趙 樂(lè)，張曉桐，劉利軍，謝水琪，靳奇文，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）作為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的乳酸菌被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵與保鮮防腐領(lǐng)域，由于其代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有廣譜抑菌特性、對(duì)熱穩(wěn)定且易被蛋白酶水解的細(xì)菌素，因而有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力[1]。有研究發(fā)現(xiàn)前體物質(zhì)或代謝中間產(chǎn)物往往具有誘導(dǎo)目標(biāo)產(chǎn)物合成的作用，又因?yàn)榧?xì)菌素是蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，因此氨基酸可以作為合成細(xì)菌素的外源誘導(dǎo)物[2]。本課題組系統(tǒng)研究了L.plantarumKLDS1.0391產(chǎn)細(xì)菌素的特點(diǎn)[3]，其所產(chǎn)細(xì)菌素N末端的氨基酸組成為纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-甘氨酸，但還不清楚該菌細(xì)菌素合成是否受上述氨基酸調(diào)節(jié)。有研究稱，氨基酸不僅是細(xì)菌素的合成底物，還可能發(fā)揮著其他一些功能，如對(duì)細(xì)菌素合成、釋放及調(diào)控過(guò)程中相關(guān)酶的誘導(dǎo)[4]。Vazquez等[5]在研究多種氨基酸及其組合方式對(duì)Nisin合成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)能的產(chǎn)生依賴于多種相互作用，而細(xì)菌素的產(chǎn)生僅受半胱氨酸和色氨酸的刺激，其中脯氨酸抑制Nisin的合成。易華西[6]在研究氨基酸種類及外源添加物對(duì)細(xì)菌素合成量的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)只有半胱氨酸和甘氨酸可顯著誘導(dǎo)細(xì)菌素Bac-J23的合成。目前，氨基酸在調(diào)節(jié)信號(hào)分子的產(chǎn)生及調(diào)控細(xì)菌素合成相關(guān)基因的表達(dá)等方面的報(bào)道還很有限，且氨基酸對(duì)細(xì)菌素加工和釋放過(guò)程中的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、信號(hào)肽及組氨酸蛋白激酶等具有誘導(dǎo)作用也僅處于猜測(cè)階段。因此，氨基酸對(duì)乳酸菌細(xì)菌素的調(diào)控機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

本研究旨在通過(guò)測(cè)定L.plantarumKLDS1.0391菌株在氨基酸脅迫下的生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成情況，并從基因水平上分析氨基酸對(duì)細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、群體感應(yīng)相關(guān)基因及氨基酸代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，旨在為進(jìn)一步研究氨基酸對(duì)細(xì)菌素的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

L.plantarumKLDS1.0391野生型菌株保藏于乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC6633，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[7]配制；化學(xué)成分確定培養(yǎng)基（chemically defined medium，CDM）參照Vazquez等[5]的方法進(jìn)行配制。

1.1.3 試劑

Primer ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green?Premix ExTaq? II實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）試劑盒、DL5000/2000 DNA Marker 寶生物工程有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、dNTPs、TaqDNA polymerase天根生化科技有限公司；過(guò)氧化氫酶、乳酸（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；Uvmini-1240紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；光學(xué)顯微鏡 上海光學(xué)儀器一廠；GL-21M高速冷凍離心機(jī)上海市離心機(jī)械研究所；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；9700 PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)Applied Biosystem公司；Step One PlusTMreal-time PCR儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；1000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Nanodrop公司；LGJ-1冷凍干燥機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng)

取-80 ℃冰箱中保藏的L.plantarumKLDS1.0391接種至MRS培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)16 h，B.subtilisATCC6633接種至LB培養(yǎng)基中于30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，活化3 代后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 氨基酸缺失對(duì)L.plantarumKLDS1.0391生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成的影響

取10 mL培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液，經(jīng)離心后用磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3 次后重懸于該緩沖液中，再以2%接種量分別接種于MRS、CDM和20 種氨基酸分別單缺失的CDM中，37 ℃培養(yǎng)28 h，每隔2 h取樣，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定光密度值（OD600nm），同時(shí)采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)活菌數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線，另取20 mL菌液用于細(xì)菌素效價(jià)測(cè)定。

1.3.3 細(xì)菌素效價(jià)的測(cè)定

菌液排除酸和過(guò)氧化氫的干擾，并經(jīng)膜過(guò)濾后凍干濃縮，以B.subtilis作為上層指示菌，利用雙層平板打孔法測(cè)量抑菌圈直徑[8]，并進(jìn)行細(xì)菌素效價(jià)的換算[9]，同時(shí)記錄能觀察到明顯抑菌圈的最高稀釋倍數(shù)（D）。抑菌圈直徑與稀釋度關(guān)系見(jiàn)式（1）：

式中：R為抑菌圈直徑/mm；d為稀釋度，即上樣量/稀釋倍數(shù)；a、b為待測(cè)系數(shù)。

抑菌圈直徑與細(xì)菌素效價(jià)的換算見(jiàn)式（2）：

據(jù)此獲得37 ℃條件下L.plantarumKLDS1.0391在CDM培養(yǎng)24 h的細(xì)菌素抑菌活性標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=9.421 1x+0.693 9，其中，y代表抑菌圈直徑（mm），x代表稀釋度的對(duì)數(shù)值。

1.3.4 乳酸含量的測(cè)定

分別取在20 種氨基酸單缺失的CDM中培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液各1.5 mL，12 000 r/min離心15 min，將發(fā)酵上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，采用高效液相色譜法測(cè)定乳酸含量，以全CDM為對(duì)照。

色譜條件[10]：色譜柱：Biorad Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相：5 mmol/L硫酸溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：65 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

在上述條件下，獲得乳酸保留時(shí)間為（14.54±0.02）min，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=920 334x-37 495，R2=0.998 9，其中y表示乳酸液相色譜中的峰面積（mV·s），x表示乳酸的質(zhì)量濃度（g/L）。

1.3.5 賴氨酸脅迫對(duì)L.plantarumKLDS1.0391生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成的影響

調(diào)節(jié)CDM中賴氨酸質(zhì)量濃度分別為0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 g/L，以2%接種量接種L.plantarumKLDS1.0391，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定細(xì)菌素效價(jià)并采用平板菌落法計(jì)數(shù)活菌數(shù)量。

1.3.6 real-time PCR測(cè)定基因相對(duì)表達(dá)量

1.3.6.1 菌體收集

將L.plantarumKLDS1.0391以2%接種量分別接種至全CDM、賴氨酸單缺失的CDM，以及賴氨酸添加量分別為0.1、1.0、2.0 g/L的CDM中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，取500 μL于4 ℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體。

1.3.6.2 RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

按照天根RNA prep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取菌體總RNA，根據(jù)所提取的RNA濃度，通過(guò)去除基因組DNA反應(yīng)對(duì)即將逆轉(zhuǎn)錄的RNA含量進(jìn)行歸一化。具體按Primer ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書在冰浴條件下混合體系并合成cDNA，合成后于-20 ℃保存。

1.3.6.3 real-time PCR引物設(shè)計(jì)

采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)real-time PCR所用引物（表1），部分引物的設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[11]。

表1 real-time PCR引物及條件Table 1 Real-time PCR primers and conditions

1.3.6.4 real-time PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

以16S rDNA作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，并記錄循環(huán)閾值（Ct值）。以2-ΔΔCt相對(duì)定量法分析不同樣品基因的表達(dá)差異。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 L.plantarum KLDS1.0391在MRS與CDM中的生長(zhǎng)及抑菌活性

L.plantarumKLDS1.0391在CDM和MRS中生長(zhǎng)的遲滯期分別為0～2 h和0～4 h，前者在10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，后者在12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期（圖1）。菌株在MRS和CDM中培養(yǎng)24 h時(shí)OD600nm分別為1.79±0.02和1.32±0.01，抑菌圈直徑分別為（23.36±0.32）mm和（19.99±0.45）mm。雖然L.plantarumKLDS1.0391在MRS培養(yǎng)基中比CDM中生長(zhǎng)能力更強(qiáng)，但CDM的組成成分明確，培養(yǎng)24 h時(shí)菌體濃度滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，所以選擇CDM作為后續(xù)氨基酸單缺失實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。由于抑菌活性在培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)到最大（圖1），因此選擇培養(yǎng)24 h取樣測(cè)定抑菌活性。

圖1 L.plantarum KLDS1.0391在MRS與CDM中的生長(zhǎng)及抑菌活性Fig.1 Growth and antibacterial activity of L.plantarum KLDS1.0391 in MRS and CDM

2.2 氨基酸單缺失對(duì)L.plantarum KLDS1.0391生長(zhǎng)和抑菌活性的影響

采用單個(gè)氨基酸遺漏技術(shù)探究氨基酸對(duì)L.plantarumKLDS1.0391生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。研究發(fā)現(xiàn)大部分情況下該菌能夠在單獨(dú)缺失一種氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，并于9～10 h達(dá)到對(duì)數(shù)期末期。苯丙氨酸家族氨基酸中（圖2A），除色氨酸的缺失不利于菌體生長(zhǎng)外，其余氨基酸的缺失對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較??；丙酮酸家族氨基酸中（圖2B），纈氨酸和丙氨酸的缺失會(huì)嚴(yán)重抑制該菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)12 h時(shí)OD600nm分別為0.55±0.01和0.54±0.02，而亮氨酸和異亮氨酸的缺失對(duì)KLDS1.0391的生長(zhǎng)基本沒(méi)有影響，發(fā)酵12 h時(shí)OD600nm分別為0.94±0.01和0.93±0.02，菌株基本保持了在全CDM中的生長(zhǎng)水平；絲氨酸家族氨基酸中（圖2E），甘氨酸的缺失導(dǎo)致該菌生長(zhǎng)遲緩，培養(yǎng)12 h時(shí)OD600nm僅為0.50±0.01。結(jié)果表明，當(dāng)CDM中缺失丙氨酸（圖2B）、天冬氨酸（圖2C）、纈氨酸（圖2B）、甘氨酸（圖2E）或谷氨酸（圖2D）會(huì)嚴(yán)重阻礙L.plantarumKLDS1.0391的生長(zhǎng)，培養(yǎng)14 h后OD600nm僅維持在0.50～0.65之間，推測(cè)上述5 種氨基酸為L(zhǎng).plantarumKLDS1.0391生長(zhǎng)的必需氨基酸。

圖2 L.plantarum KLDS1.0391在缺失單氨基酸的CDM中的生長(zhǎng)Fig.2 Growth of L.plantarum KLDS1.0391 in CDM medium deficient in single amino acids

圖3結(jié)果表明，天冬氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺缺失，導(dǎo)致L.plantarumKLDS1.0391菌落總數(shù)和細(xì)菌素合成量均顯著降低（P＜0.05）；谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、色氨酸及纈氨酸缺失僅影響菌體生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)菌素合成無(wú)明顯影響。經(jīng)平板菌落總數(shù)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，與全CDM相比，當(dāng)培養(yǎng)基中分別缺失賴氨酸和甲硫氨酸，活菌數(shù)分別下降了3.09%和2.28%，但兩者發(fā)酵上清液的抑菌活性則分別降低了44.21%和34.10%（圖3）。由此推測(cè)，由于賴氨酸和甲硫氨酸單缺失導(dǎo)致的生長(zhǎng)稍緩慢不是該菌細(xì)菌素合成量顯著下降的主要原因。

圖3 L.plantarum KLDS1.0391在氨基酸單缺失的CDM中培養(yǎng)24 h后的活菌數(shù)量及抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of L.plantarum KLDS1.0391 cultured in CDM medium deficient in single amino acids for 24 h

2.3 氨基酸單缺失對(duì)L.plantarum KLDS1.0391培養(yǎng)上清液乳酸含量的影響

與全CDM相比，賴氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸及蘇氨酸這9 種氨基酸分別單缺失后，乳酸含量升高。其中，賴氨酸及甲硫氨酸單缺失后細(xì)菌素抑菌活性下降，而乳酸含量較全CDM對(duì)照組分別提高了5.10%及4.20%。其余11 種氨基酸的單缺失均導(dǎo)致乳酸含量下降，其中丙氨酸單缺失后乳酸含量較對(duì)照組下降了16.16%。由此推測(cè)，氨基酸單缺失使得胞內(nèi)碳源代謝重新定向，不同氨基酸的缺失導(dǎo)致碳源流向乳酸合成支路的流量存在較大差異。

圖4 L.plantarum KLDS1.0391在氨基酸單缺失的CDM中培養(yǎng)24 h后的乳酸含量Fig.4 Lactic acid content in the culture supernatant of L.plantarum KLDS1.0391 cultured in CDM medium deficient in single amino acids for 24 h

2.4 外源賴氨酸對(duì)L.plantarum KLDS1.0391生長(zhǎng)和抑菌活性的影響

上述研究結(jié)果表明，賴氨酸顯著影響該菌株抑菌活性，因此進(jìn)一步研究了外源添加不同質(zhì)量濃度賴氨酸對(duì)該菌生長(zhǎng)及抑菌活性的影響，結(jié)果表明：菌體數(shù)量隨外源賴氨酸添加量變化無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖5A）。在賴氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g/L前，隨其質(zhì)量濃度遞增細(xì)菌素合成量也隨之增大（圖5B）。當(dāng)賴氨酸質(zhì)量濃度為0.1 g/L和1.0 g/L時(shí)，細(xì)菌素抑菌活性分別為1 638.54 AU/mL和2 002.83 AU/mL。繼續(xù)增至2.0 g/L時(shí)，抑菌活性達(dá)到最大值2 260.98 AU/mL。當(dāng)賴氨酸質(zhì)量濃度超過(guò)2.0 g/L后，隨其質(zhì)量濃度的升高抑菌活性反而下降。當(dāng)其質(zhì)量濃度增至5.0 g/L和10.0 g/L時(shí)，抑菌活性分別為2 232.11 AU/mL和1 993.49 AU/mL。該結(jié)果顯示，過(guò)量賴氨酸會(huì)產(chǎn)生反饋抑制效果，脅迫或抑制細(xì)菌素的合成分泌。由此表明賴氨酸對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，但卻與細(xì)菌素分泌表達(dá)密切關(guān)聯(lián)。

圖5 L.plantarum KLDS1.0391在添加賴氨酸CDM中培養(yǎng)24 h后的菌體數(shù)量（A）及抑菌活性（B）Fig.5 Growth (A) and antibacterial activity (B) of L.plantarum KLDS1.0391 cultured in CDM medium supplemented with Lys

2.5 賴氨酸脅迫對(duì)L.plantarum KLDS1.0391相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.5.1 菌株在賴氨酸缺失CDM中培養(yǎng)時(shí)相關(guān)基因的表達(dá)L.plantarumKLDS1.0391在缺失賴氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至24 h時(shí)，細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因plnEF、群體感應(yīng)調(diào)節(jié)基因plnD與plNC8HK的表達(dá)量均顯著下調(diào)，而編碼賴氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶的基因dapG和yclM表達(dá)量卻顯著上調(diào)（圖6）。其中基因plnEF、plnD與plNC8HK分別下調(diào)33%、18%和23%（P＜0.01），而基因dapG和yclM分別上調(diào)至對(duì)照組的2.46 倍和1.74 倍。表明基因dapG和yclM在氨基酸合成通路中起協(xié)同作用，賴氨酸缺失后二者表達(dá)上調(diào)進(jìn)而合成蛋白質(zhì)以保證菌株正常生長(zhǎng)代謝。

圖6 L.plantarum KLDS1.0391在賴氨酸缺失CDM中培養(yǎng)24 h后相關(guān)基因的表達(dá)Fig.6 Expression of related genes in L.plantarum KLDS1.0391 cultured in Lys-deficient CDM for 24 h

2.5.2 菌株在添加賴氨酸CDM中培養(yǎng)時(shí)相關(guān)基因的表達(dá)菌株在賴氨酸質(zhì)量濃度為0.1 g/L條件下培養(yǎng)24 h后，基因plnEF、plnD與plNC8HK分別上調(diào)至對(duì)照組的1.49、1.22 倍和1.30 倍（圖7）；當(dāng)賴氨酸質(zhì)量濃度增至2.0 g/L時(shí)，上述基因分別上調(diào)2.10、1.72 倍和1.81 倍（P＜0.01）。研究結(jié)果顯示，CDM中，隨賴氨酸添加量增大，細(xì)菌素合成相關(guān)基因上調(diào)水平也隨之增加。而基因dapG和yclM卻受誘導(dǎo)表達(dá)下調(diào)，當(dāng)賴氨酸質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)，二者分別下調(diào)65%和50%；當(dāng)外源添加2.0 g/L賴氨酸后，二者則分別下調(diào)69%和58%。綜上，與細(xì)菌素及氨基酸合成相關(guān)的基因上下調(diào)倍數(shù)具有濃度依賴性。

圖7 L.plantarum KLDS1.0391在添加賴氨酸CDM中培養(yǎng)24 h后相關(guān)基因的表達(dá)Fig.7 Expression of related genes in L.plantarum KLDS1.0391 cultured in CDM medium supplemented with Lys for 24 h

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)L.plantarumKLDS1.0391在單氨基酸缺失CDM中的生長(zhǎng)較全CDM均有所下降，這可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不全或氨基酸未能達(dá)到最佳比例，導(dǎo)致菌體代謝效率下降進(jìn)而影響生長(zhǎng)繁殖。Chopin[12]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、組氨酸、亮氨酸及異亮氨酸6 種氨基酸是大部分乳酸菌生長(zhǎng)的必需氨基酸，而Amoroso等[13]研究了4 株不同酒酒球菌對(duì)氨基酸的需求，結(jié)果表明大多數(shù)乳酸菌生長(zhǎng)所不可或缺的氨基酸分別是天冬酰胺、異亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丙氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、甘氨酸和精氨酸是L.plantarumKLDS1.0391生長(zhǎng)的必需氨基酸，由此可以看出菌株對(duì)不同氨基酸的需求模式因種屬差異而有明顯不同。本研究中，亮氨酸和異亮氨酸的缺失幾乎不影響該菌株生長(zhǎng)，由氨基酸代謝通路可知，異亮氨酸可經(jīng)蘇氨酸脫氨或蘇氨酸脫氨基酶催化天冬氨酸等多種途徑合成[14]，因此該菌株在外源缺失異亮氨酸時(shí)還可正常代謝。Chen He等[15]研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸和賴氨酸對(duì)Streptococcus thermophilus的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，且活菌數(shù)與氨基酸濃度呈正比關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)谷氨酸家族氨基酸中，除谷氨酸的缺失顯著影響L.plantarumKLDS1.0391的生長(zhǎng)外，其余氨基酸的缺失對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不大，這與Chen He等[15]的研究結(jié)果基本一致。L.plantarumKLDS1.0391在甘氨酸缺失后菌體幾乎停止生長(zhǎng)，穩(wěn)定期末期OD600nm僅為0.50±0.01，有研究報(bào)道甘氨酸可調(diào)控胞內(nèi)多種代謝途徑，如糖異生、嘌呤合成、谷胱甘肽的合成途徑等[16]，由此推測(cè)甘氨酸缺失可間接導(dǎo)致胞內(nèi)能源物質(zhì)減少進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)。Stuart等[17]研究發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠作為菌株代謝合成某些生長(zhǎng)必需營(yíng)養(yǎng)因子的前體物質(zhì)，精氨酸會(huì)通過(guò)代謝產(chǎn)能（ADI途徑）進(jìn)而促進(jìn)菌體量增加。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中缺失精氨酸時(shí)，L.plantarumKLDS1.0391的生長(zhǎng)速率減緩，再次說(shuō)明精氨酸可通過(guò)ADI途徑為菌體生長(zhǎng)提供某種重要前體物質(zhì)及能量。

目前，可通過(guò)篩選細(xì)菌素高產(chǎn)菌株[18]、優(yōu)化發(fā)酵條件[19]、異源表達(dá)[20]、脅迫刺激和誘導(dǎo)調(diào)控等技術(shù)使乳酸菌細(xì)菌素高效表達(dá)[21]，但多數(shù)研究都聚焦于遺傳學(xué)方法[22]，而通過(guò)外源物質(zhì)誘導(dǎo)提高細(xì)菌素是基于代謝及轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控且不涉及安全問(wèn)題，因此有必要系統(tǒng)的研究培養(yǎng)基成分對(duì)細(xì)菌素的調(diào)控。Kuipers[23]和Diep[24]等發(fā)現(xiàn)單個(gè)氨基酸可誘導(dǎo)細(xì)菌素或相關(guān)肽的合成，本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的賴氨酸對(duì)細(xì)菌素合成起正向調(diào)控作用。除此之外，Yi Huaxi等[2]研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸和甘氨酸能提高細(xì)菌素產(chǎn)量；Devuyst[25]驗(yàn)證了半胱氨酸在用量低于0.1%時(shí)對(duì)Nisin的合成起正向誘導(dǎo)作用；Vazquez等[5]認(rèn)為僅半胱氨酸和色氨酸能夠刺激Nisin的合成，這與Devuyst[25]的結(jié)果存在差異，由此表明，誘導(dǎo)細(xì)菌素合成的外源氨基酸可因菌屬種類而存在較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸的缺失對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，但卻導(dǎo)致細(xì)菌素合成量顯著下降（P＜0.05）。Devuyst[25]與Vazquez等[5]認(rèn)為氨基酸不僅作為細(xì)菌素合成的前體，還可能作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)菌素合成及分泌過(guò)程中相關(guān)酶的活性。綜上推測(cè)，賴氨酸可能作為底物直接參與L.plantarumKLDS1.0391細(xì)菌素的合成，還可能對(duì)細(xì)菌素加工釋放相關(guān)酶及蛋白具有誘導(dǎo)作用。

前期課題組將L.plantarumKLDS1.0391全基因組測(cè)序結(jié)果與5 種完全測(cè)序的L.plantarum（WCFS1、NC8、ZJ316、LZ206等）進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌素基因簇包含plnBD、plnEFI、plnGHSTUV和plnXY4 個(gè)操縱子[26]。其中，plnEF編碼細(xì)菌素結(jié)構(gòu)蛋白，plNC8HK編碼組氨酸蛋白激酶，plnD編碼細(xì)胞質(zhì)感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白[11]。研究結(jié)果顯示：菌株在賴氨酸單獨(dú)缺失下培養(yǎng)24 h后，基因plnEF、plNC8HK和plnD均顯著下調(diào)（P＜0.01），而添加一定質(zhì)量濃度的賴氨酸后三者顯著上調(diào)（P＜0.01），表明賴氨酸會(huì)顯著影響雙組分調(diào)控系統(tǒng)，進(jìn)而控制細(xì)菌素的合成。天冬氨酸及谷氨酸代謝途徑是合成賴氨酸、甲硫氨酸以及異亮氨酸等多種分支氨基酸的有效途徑，因此研究氨基酸合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因，可進(jìn)一步深入了解氨基酸調(diào)控細(xì)菌素合成的機(jī)制。Jakobsen等[27]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)編碼天冬氨酸激酶的基因dapG、lysC和yclM，野生型甲醇桿菌MGA3中賴氨酸產(chǎn)量增加。Nardal等[28]克隆并測(cè)序了甲醇桿菌天冬氨酸代謝途徑中的8 個(gè)基因以闡明它們對(duì)賴氨酸合成的調(diào)控作用，其中dapG編碼天冬氨酸激酶I蛋白，yclM編碼天冬氨酸激酶III蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，合成賴氨酸和甲硫氨酸的關(guān)鍵基因dapG和yclM在賴氨酸單獨(dú)缺失后，兩者表達(dá)均顯著上調(diào)，表明氨基酸缺失時(shí)，為保證菌體正常生長(zhǎng)代謝，細(xì)菌需新合成蛋白質(zhì)替代受損或功能失常的蛋白質(zhì)進(jìn)而抵御氨基酸缺失；而培養(yǎng)基中一定質(zhì)量濃度的賴氨酸脅迫導(dǎo)致上述兩種基因表達(dá)下調(diào)，表明外源賴氨酸對(duì)二者的表達(dá)起反饋抑制作用。

目前，隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，采用轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及代謝組等多組學(xué)技術(shù)研究乳酸菌功能性代謝產(chǎn)物的合成機(jī)理，已被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[29]。有報(bào)道稱，氨基酸對(duì)其他微生物的代謝產(chǎn)物具有調(diào)控作用。甲硫氨酸可誘導(dǎo)異青霉素N合成酶等進(jìn)而刺激頭孢菌素C的合成，色氨酸既可作為麥角生物堿合成的底物，也可作為外源誘導(dǎo)物發(fā)揮作用[30]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，賴氨酸顯著影響L.plantarumKLDS1.0391細(xì)菌素的合成，但具體作用機(jī)制還有待利用生物信息學(xué)進(jìn)一步闡明。

4 結(jié) 論

結(jié)果表明，天冬氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺缺失后菌株的生長(zhǎng)能力及細(xì)菌素合成量均顯著降低（P＜0.05）。賴氨酸缺失及過(guò)量對(duì)菌體生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，但卻顯著影響細(xì)菌素的合成。當(dāng)外源賴氨酸質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 g/L前，細(xì)菌素抑菌活性隨賴氨酸添加量的增大而增大，賴氨酸可能作為細(xì)菌素合成底物正向誘導(dǎo)該菌細(xì)菌素合成。當(dāng)賴氨酸質(zhì)量濃度超過(guò)2.0 g/L后，過(guò)量賴氨酸對(duì)細(xì)菌素合成起反饋抑制作用?；騞apG和yclM在氨基酸合成通路中起協(xié)同作用，賴氨酸缺失后二者表達(dá)顯著上調(diào)進(jìn)而合成蛋白質(zhì)以保證菌株正常代謝。