張高川，何超永，王崇龍，王大慧*，衛(wèi)功元*

（蘇州大學基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123）

普魯蘭是一種由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）合成的水溶性直鏈高分子物質[1]。作為一種微生物胞外多糖，普魯蘭本身安全無毒，同時具有良好的可塑性、成膜性和穩(wěn)定性，以及耐熱、耐酸堿、耐鹽等特性，因而可以廣泛地應用于食品加工、臨床醫(yī)藥、環(huán)境保護和輕工化工等諸多領域[2-4]。美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)將普魯蘭認證為GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物多糖，我國也于2006年將普魯蘭列為新增的4 種食品添加劑之一[5]。此后，普魯蘭在市場上的需求量日益增長。

在普魯蘭的發(fā)酵生產(chǎn)中，普魯蘭產(chǎn)量和分子質量是兩個重要的過程參數(shù)，前者決定普魯蘭生產(chǎn)的得率和效率，而后者關系到普魯蘭的應用范圍[6]。影響普魯蘭產(chǎn)量和分子質量的因素有很多，既包括培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分及其配比，又涉及生產(chǎn)菌株培養(yǎng)的環(huán)境條件[7-8]。其中，培養(yǎng)基中無機鹽及其含量在普魯蘭的生產(chǎn)中往往具有重要的作用。Badr-Eldin等[9]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸鹽水平偏低不利于菌體生長，偏高則抑制普魯蘭合成。Reeslev等[10]發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中Zn2+濃度高于0.45 μmol/L時，出芽短梗霉的形態(tài)即從酵母狀細胞向菌絲狀轉變，普魯蘭的合成隨之受到不利影響[6]。鞠寶等[11]分析了二價陽離子在普魯蘭和黑色素形成中的作用，結果表明合適的金屬離子種類和濃度抑制了黑色素的形成，促進了普魯蘭的合成。Gao Wa等[12]在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優(yōu)化了培養(yǎng)基中無機鹽含量，提高了普魯蘭產(chǎn)量。與此同時，還發(fā)現(xiàn)影響出芽短梗霉細胞生長的最顯著因素是磷酸氫二鉀，而氯化鈉（NaCl）則是影響普魯蘭合成的最顯著因素[13]。以上結果均是基于發(fā)酵過程優(yōu)化而得到的，這些研究并沒有對無機鹽影響普魯蘭生物合成的內在機制進行深入分析。

在前期優(yōu)化普魯蘭發(fā)酵培養(yǎng)基的研究中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中NaCl的存在有利于提高普魯蘭產(chǎn)量，但卻顯著降低了普魯蘭的分子質量[6]。通過對普魯蘭合成關鍵酶（α-磷酸葡萄糖異構酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖基轉移酶）的活性、物質和能量代謝進行測定，發(fā)現(xiàn)NaCl同時提高了與普魯蘭生物合成和降解相關酶的活性，增加了能量物質ATP的供給，結果部分揭示了NaCl在提高普魯蘭產(chǎn)量的同時卻降低了普魯蘭分子質量的生理機制[14]。盡管如此，NaCl如何在分子水平影響出芽短梗霉胞內相關基因的表達，并體現(xiàn)在普魯蘭的產(chǎn)量和分子質量上，這些問題至今仍然不得而知。

轉錄組測序（RNA-Seq）技術是通過對細胞轉錄產(chǎn)物進行測序，統(tǒng)計測得的每條序列，獲得每個特定轉錄本的表達量，可更加精確地評估細胞表型，加深對細胞代謝的理解，也有助于對目標基因進行改良[15]。近年來，RNA-Seq因檢測動態(tài)范圍寬、數(shù)據(jù)重復性好等優(yōu)勢，逐漸成為研究基因表達差異、新基因挖掘與功能注釋的重要手段[16]。RNA-Seq技術和生物信息學分析手段已經(jīng)廣泛運用于微生物過程分析中，為深入理解微生物現(xiàn)象中蘊含的分子機制提供了可信的證據(jù)[17-20]。為此，本實驗研究NaCl對出芽短梗霉細胞轉錄組的影響，采用生物信息學方法篩選與分析差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），并對這些DEGs進行注釋與富集分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

出芽短梗霉CCTCC M 2012259，由蘇州大學微生物生理與代謝調控研究室保藏。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母粉3 g/L，(NH4)2SO40.6 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 3.8，NaCl質量濃度根據(jù)具體實驗設計而定。

所有試劑均為國產(chǎn)分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Minifors實驗室臺式5 L發(fā)酵罐 瑞士Infors公司；HZ-2010K恒溫搖瓶柜 太倉市華利達實驗儀器設備有限公司；J6-MI型冷凍離心機 美國Beckman公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；1836稀釋型烏式毛細管黏度計 浙江臺州市椒江玻璃儀器廠；2100生物分析儀 美國安捷倫科技公司；Qubit 2.0熒光分光光度計 美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將在-70 ℃超低溫冰箱中保藏的菌種（1 mL）接種至50 mL種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以10%（V/V）的接種量，將種子液接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在200 r/min搖床中培養(yǎng)72 h，溫度30 ℃。

分批發(fā)酵培養(yǎng)：以10%（V/V）的接種量，將種子液接種至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，溫度30 ℃，攪拌轉速400 r/min，通氣量3 L/min。pH值采用梅特勒電極在位監(jiān)測，通過自動流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH溶液控制pH值為3.80±0.02。

1.3.3 指標測定

細胞干質量和普魯蘭產(chǎn)量的測定方法參見文獻[5]；普魯蘭分子質量的測定采用黏度法[6]；葡萄糖質量濃度的測定采用3,5-二硝基水楊酸法[21]；分批發(fā)酵過程參數(shù)的計算方法參見文獻[8]。

1.3.4 出芽短梗霉RNA-Seq

1.3.4.1 RNA提取

將分批發(fā)酵培養(yǎng)至36 h的出芽短梗霉細胞8 000 r/min、4 ℃離心10 min，液氮猝滅2 min；利用TRIzol試劑盒提取總RNA。采用Agilent 2100生物分析儀、NanoDrop和1%瓊脂糖凝膠對總RNA進行品質和定量分析。選擇1 μg RNA完整值（RNA integrity number，RIN）大于7的總RNA用于后續(xù)文庫制備。

1.3.4.2 cDNA文庫構建

根據(jù)NEBNext?UltraTMRNA文庫制備試劑盒的操作步驟進行測序文庫制備。首先使用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module從總RNA中分離Poly(A) mRNA，然后利用NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer和NEBNext Random Primers對mRNA進行破碎（約300 bp）和引物配對。以此為模板，利用ProtoScript II逆轉錄酶合成第1條cDNA鏈，利用Second Strand Synthesis Enzyme Mix合成第2條cDNA鏈。之后用AxyPrep Mag PCR Clean-up純化雙鏈cDNA產(chǎn)物，使用Agilent 2100生物分析儀評估其品質，使用Qubit 2.0熒光分光光度計對其進行定量。最后使用End Prep Enzyme Mix修復純化后的雙鏈cDNA產(chǎn)物，添加dA尾巴，并通過T-A連接在其末端添加接頭。

1.3.4.3 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析

利用Illumina HiSeqTM2000對上述構建的cDNA文庫進行150 bp讀長的雙末端測序，獲得的RNA-Seq數(shù)據(jù)經(jīng)FASTQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）質控分析后，使用Trimmomatic（v0.30）軟件刪除測序質量偏低的末端序列片段[22]，處理后的干凈讀段（clean reads）用于后續(xù)分析。將RNA-Seq數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，登記號為PRJNA350822（https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA350822）。

雖然已經(jīng)對出芽短梗霉全基因組進行測序[23]，但缺少完善的注釋信息，所以RNA-Seq數(shù)據(jù)分析采用基于Trinity（v2.6.6）從頭組裝的無參分析流程[24]。利用Trinity軟件對RNA-Seq數(shù)據(jù)進行從頭組裝，利用BLASTX（2.7.1+）程序[25]，將Trinity組裝獲得的所有轉錄本與來自UniprotKB數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）的34 084 個真菌已知蛋白進行比對（截止日期2019-05-14），鑒別這些組裝轉錄本可能編碼的蛋白（統(tǒng)計期望閾值為1×10-5）。

使用RSEM（v1.3.1）軟件的RSEM-prepare-reference程序，根據(jù)Trinity組裝結果創(chuàng)建參考轉錄組；使用RSEM-calculate-expression工具計算Trinity組裝轉錄本在每個樣本中的表達水平；利用RSEM-generate-datamatrix程序，將所有樣本的基因表達數(shù)據(jù)合并為一個數(shù)據(jù)矩陣[26]，用于DEGs分析。

1.3.4.4 DEGs的鑒別

利用R語言包edgeR（v3.20.9）對上述基因表達水平數(shù)據(jù)矩陣進行計算分析[27]，鑒別因培養(yǎng)基中添加NaCl而產(chǎn)生的DEGs。將基因差異表達倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）閾值設為2 倍，統(tǒng)計顯著性閾值設為0.05，作為DEGs的篩選標準[28]。對篩選結果進行可視化分析，繪制火山圖。利用R語言包pheatmap（v1.0）對DEGs進行聚類和可視化分析，用來評估平行樣本的一致性。

1.3.4.5 DEGs的功能注釋與富集分析

利用UniProt Retrieve/ID mapping tool（http://www.uniprot.org/uploadlists）在線工具，從Uniprot數(shù)據(jù)庫中獲取所有DEGs對應蛋白質的基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋信息和序列信息。利用WEGO（http://wego.genomics.org.cn/）對其進行GO注釋的富集分析[29]，使用R語言包ggplot2對富集結果進行可視化。利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）數(shù)據(jù)庫的Blast-KOALA工具（https://www.kegg.jp/blastkoala），分別對上調和下調的DEGs進行通路富集分析[30]，并利用KEGG mapper工具對其中的通路模塊進行深入挖掘。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

RNA-Seq設置2 個平行樣品，其他所有實驗數(shù)據(jù)均來自于3 組平行樣品，應用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 NaCl對普魯蘭生物合成的影響

在搖瓶發(fā)酵條件下，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl質量濃度對出芽短梗霉細胞生長和普魯蘭合成的影響，結果見圖1。可以看出，與對照（0 g/L NaCl）相比，NaCl的添加提高了普魯蘭產(chǎn)量，但降低了細胞干質量和普魯蘭分子質量。當NaCl質量濃度為3 g/L時，普魯蘭產(chǎn)量達到最大值23.17 g/L，比對照提高了22.9%；而細胞干質量和普魯蘭分子質量在此質量濃度下均處于最低水平，分別比對照降低了12.7%和44.9%。以上結果表明，培養(yǎng)基中NaCl的存在有利于普魯蘭產(chǎn)量的提高，但不利于將普魯蘭分子質量維持在較高的水平。

圖1 NaCl質量濃度對普魯蘭生物合成的影響Fig.1 Effect of NaCl at different concentrations on pullulan biosynthesis

2.2 普魯蘭分批發(fā)酵過程參數(shù)比較

在5 L發(fā)酵罐中對出芽短梗霉CCTCC M 2012259進行分批培養(yǎng)，檢測了3 g/L NaCl和對照條件下的葡萄糖消耗、細胞生長和普魯蘭合成情況，結果見圖2和表1。通過對各個發(fā)酵過程參數(shù)進行比較可以發(fā)現(xiàn)，NaCl加快了葡萄糖的消耗速率，但卻降低了細胞生長的速率。因此，當培養(yǎng)基中含有NaCl時，細胞并沒有將多消耗的葡萄糖用于細胞生長，而是用于普魯蘭的合成，最終細胞干質量比對照降低了16.5%，普魯蘭產(chǎn)量卻比對照提高17.6%。需要特別指出的是，在NaCl存在的情況下，普魯蘭最終分子質量顯著下降55.8%。綜合表1中分批發(fā)酵其他過程參數(shù)，可以得出結論，與對照相比，3 g/L NaCl顯著提高了普魯蘭產(chǎn)量，卻同時顯著降低了細胞干質量和普魯蘭分子質量。以下將采用RNA-Seq技術和生物信息學分析手段對NaCl影響普魯蘭生物合成的分子機制進行解析。

圖2 不同NaCl質量濃度下的普魯蘭分批發(fā)酵過程Fig.2 Time-course curve of pullulan production in batch fermentation at different concentrations of NaCl

表1 普魯蘭分批發(fā)酵過程參數(shù)比較Table 1 Comparison of cell growth and pullulan production in batch fermentation in the presence and absence of NaCl

2.3 RNA-Seq分析

2.3.1 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析

對來自0 g/L和3 g/L NaCl培養(yǎng)條件下的出芽短梗霉細胞樣本進行RNA-Seq，共獲得近9 240萬 條讀段（reads），總長度約27.72 G堿基。4 個轉錄組樣本的Q30（0.1%堿基識別錯誤率）均在93%左右（表2），表明這些RNA-Seq數(shù)據(jù)具有較高的質量，能夠滿足后續(xù)生物信息學分析的要求。通過FASTQC質控分析和trimmomatic處理后，使用Trinity（v2.6.6）對這些測序結果進行從頭組裝，共獲得16 204 個基因和29 523 條轉錄本。通過與真菌已知蛋白進行比對，BLASTX程序成功鑒別出其中的16 130 條轉錄本。

表2 RNA-Seq數(shù)據(jù)Table 2 Overview of RNA-Seq data for A.pullulans

2.3.2 DEGs分析

利用edgeR對RSEM軟件計算獲得的Trinity組裝轉錄本表達水平數(shù)據(jù)矩陣進行篩選，除去低表達基因后，在剩下的14 098 個轉錄本中鑒別DEGs。將統(tǒng)計顯著性閾值（P值）設為0.05，則有659 個DEGs被鑒別出，DEGs分析的火山圖見圖3A，其中227 個DEGs表達水平在NaCl存在時顯著上調，432 個DEGs表達水平顯著下調，表明培養(yǎng)基中的NaCl對出芽短梗霉的基因轉錄水平產(chǎn)生了顯著影響。利用pheatmap對這些DEGs進行聚類分析（圖3B），結果顯示，該RNA-Seq數(shù)據(jù)分析結果可用于后續(xù)的基因功能注釋和代謝通路分析。

圖3 NaCl存在時DEGs分析可視化圖譜Fig.3 Volcano map and heatmap of DEGs in the presence of NaCl

2.3.3 DEGs功能注釋和富集分析

利用WEGO對在NaCl組中表達水平顯著上調的227 個基因和顯著下調的432 個基因分別進行GO功能注釋及富集分析，共有169 個上調基因和360 個下調基因獲得GO功能注釋信息。利用R語言包ggplot2對富集結果進行可視化分析，結果見圖4?？梢钥闯觯贜aCl組中顯著上調的基因，主要富集在初級代謝、氮化合物代謝、生物合成等生物學過程，具有離子綁定、水解酶活性、小分子綁定等分子功能，且大多在胞內細胞器尤其是具有膜結構的細胞器中發(fā)揮作用；在NaCl組中顯著下調的基因，其富集的生物學過程、分子功能和細胞組分均與上調基因相似。由此可見，培養(yǎng)基中NaCl的存在，影響了細胞中的一些水解酶，以及具有離子和小分子綁定功能的蛋白編碼基因的表達水平，這些均可能與普魯蘭產(chǎn)量和分子質量的改變有關。

圖4 NaCl存在時DEGs的GO功能注釋及富集分析Fig.4 GO functional annotation and enrichment analysis of DEGs in the presence of NaCl

2.3.4 DEGs的KEGG代謝通路分析

使用KEGG的Blast-KOALA工具對NaCl組中表達水平顯著上調的227 個基因和下調的432 個基因進行代謝通路分析，分別有109 個上調基因和224 個下調基因被KEGG注釋（表3）。結果表明，上調基因主要富集于遺傳信息過程、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等相關通路，而下調基因則主要富集于碳水化合物代謝、遺傳信息過程、信號與細胞過程等相關通路。在此基礎上，利用KEGG mapper工具對其中的通路模塊進行深入挖掘，發(fā)現(xiàn)分別有58 個上調基因和112 個下調基因編碼各類酶（表4），其中，上調基因編碼的酶參與的代謝通路主要包括次級代謝物生物合成、抗生素生物合成、不同環(huán)境下的微生物代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生等代謝過程，而下調基因編碼的酶參與的代謝過程除了上述通路以外，還參與了碳代謝、氨基酸生物合成、丙酮酸代謝、氧化磷酸化等代謝過程。

表3 DEGs的KEGG通路富集分析Table 3 KEGG pathway enrichment analysis of DEGs

表4 DEGs的KEGG通路功能挖掘Table 4 KEGG pathway functional annotation of DEGs

需要特別說明的是，直接參與普魯蘭生物合成的關鍵酶基因（pgm1、pgm2、ugp、fks）和降解酶基因（amy1）在本研究中均能被注釋到，其表達水平與前期研究[14]中real-time PCR所得到的結果一致。雖然這些基因的轉錄水平在NaCl存在時均有所上調，但基因FC均小于2，因此不在鑒別出的659 個DEGs范圍之內。盡管如此，針對RNA-Seq數(shù)據(jù)的分析結果，仍然可以為今后出芽短梗霉的遺傳改造提供可信的理論依據(jù)。

3 結 論

本研究考察NaCl在普魯蘭生物合成中的作用，發(fā)現(xiàn)3 g/L NaCl最有利于普魯蘭的過量合成，但培養(yǎng)基中NaCl的存在顯著降低了普魯蘭的分子質量。在分批發(fā)酵的基礎上，采用生物信息學方法對出芽短梗霉RNA-Seq數(shù)據(jù)進行分析，共鑒別出659 個DEGs，其中NaCl組中有227 個基因表達上調，432 個基因表達下調。通過對這些DEGs進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)NaCl影響了參與碳水化合物代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生等代謝過程的基因的表達水平，最終在提高了普魯蘭產(chǎn)量的同時降低了普魯蘭分子質量。研究結果有助于深入理解NaCl在普魯蘭生物合成中的作用機制，同時也為出芽短梗霉遺傳改造以實現(xiàn)高分子質量普魯蘭的高效合成提供理論依據(jù)。