唐雪林，佟盼盼，張萌萌，張 凌，馬曉玉，馬 蕊，謝金鑫，蘇戰(zhàn)強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是國際上公認(rèn)的水體和食品衛(wèi)生檢測指示菌，也是反映革蘭氏陰性菌對抗菌藥物敏感性的指標(biāo)菌。大腸桿菌本質(zhì)上對所有抗生素敏感，但臨床治療和畜禽養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致大腸桿菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的耐藥性，已成為全球公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。大腸桿菌既可以通過自身染色體突變獲得耐藥基因，也可以通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子和基因盒等遺傳元件水平轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因[3]。

食源性動物是大腸桿菌耐藥菌的儲存庫，作為載體大腸桿菌可以將耐藥基因傳遞給其他致病菌或通過食物鏈傳給人類[4-5]。針對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類以及四環(huán)素類藥物的耐藥基因均可由質(zhì)粒介導(dǎo)傳播，并可以通過質(zhì)粒進(jìn)行積累[6]。已有研究表明，與其他食源性大腸桿菌的耐藥率相比，畜禽肉源分離株的耐藥率普遍偏高[7-8]。國外研究人員對食源性大腸桿菌進(jìn)行耐藥表型測定發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌多呈多重耐藥表型，且對四環(huán)素和氨芐西林表現(xiàn)出較高的耐藥率，對阿米卡星、頭孢他啶、慶大霉素和環(huán)丙沙星等表現(xiàn)出低耐藥率[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，不同來源大腸桿菌的耐藥率存在差異，且來自家禽肉和豬肉的大腸桿菌耐藥率更高[10]。

目前關(guān)于新疆畜禽肉源大腸桿菌的耐藥性研究相對較少。因此，本研究對烏魯木齊市售畜禽肉品中大腸桿菌的耐藥性及耐藥基因的流行特點(diǎn)進(jìn)行了分析，旨在為當(dāng)?shù)厝忸愂称返哪退幮约澳退幓虮O(jiān)測和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源 2019年6-8月，從烏魯木齊市沙依巴克區(qū)、水磨溝區(qū)、新市區(qū)等19家超市共采集動物肌肉樣品353份，其中雞肉90份、豬肉90份、牛肉84份、羊肉89份。

1.1.2 培養(yǎng)基與質(zhì)控菌 EC肉湯(E.coliBroth)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)、LB瓊脂培養(yǎng)基(Luria-Bertani Agar)、水解酪蛋白肉湯(MH Broth)，均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；科瑪嘉尿道菌群定位顯色培養(yǎng)基，購自上海欣中生物工程有限公司；質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試 劑 TaKaRaTaq、dNTP Mixture及2 000 DL Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司；Gelred核酸染料購自美國Biotium公司；乙二胺四乙酸、Tris堿、氯化鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、丙三醇、無水乙醇等，購自廣州化學(xué)試劑廠；氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦、氨曲南、慶大霉素、氨芐西林-舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氯霉素、多粘菌素B、鏈霉素和哌拉西林藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限責(zé)任公司。

1.2 大腸桿菌的分離和鑒定

根據(jù)采樣地點(diǎn)的具體情況，在超市的生鮮產(chǎn)品攤位采集3～5份畜禽肉，分別置于無菌密封袋中，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。采用無菌操作的方法取2 g肉接種到10 mL無菌EP管中，加入5 mL滅菌EC肉湯，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)后菌液劃線于MAC平板，14～16 h后挑取紅色、圓形、表面光滑的單菌落劃線科瑪嘉尿道菌群定位顯色培養(yǎng)基；37 ℃恒溫培養(yǎng)14～16 h，挑取桃紅色單菌落劃線接種于LB平板上，進(jìn)行菌種鑒定等后續(xù)試驗(yàn)。利用大腸桿菌16S rDNA特異性引物進(jìn)行PCR鑒定[11]，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×rTaqbuffer 2.5 μL，dNTP mixture 2.0 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq酶0.125 μL，模板1 μL，加超純水至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，52 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。陽性菌置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%甘油的生理鹽水中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分群分析

1.3.1 細(xì)菌DNA模板制備 采用加熱煮沸法提取菌株DNA，將大腸桿菌在LB平板上培養(yǎng)12 h，取少量細(xì)菌加入含0.5 mL 1×TE的1.5 mL EP管中混勻，隔水煮沸裂解10 min，冰浴5 min，10 000 r/min離心2 min，取上清為模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物合成 根據(jù)文獻(xiàn)[12]，選擇適用于大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育分群的基因arpA、chuA、yjaA、TspE4.C2、ArpAgpE、trpAgpC和trpBA進(jìn)行擴(kuò)增，相應(yīng)地將大腸桿菌分為A、B1、C、E、D、F和clade Ⅰ群。各基因引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 四重PCR擴(kuò)增 四重PCR反應(yīng)(arpA、chuA、yjaA、TspE4.C2)體系25 μL：10×rTaqbuffer 2.5 μL，dNTP mixture 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，rTaq酶0.125 μL，模板1 μL，加超純水至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。在四重PCR中若arpA和yjaA擴(kuò)增結(jié)果同時為陽性，則繼續(xù)用trpAgpC基因篩選大腸桿菌所屬群；若arpA和chuA，arpA、chuA和TspE4.C2，arpA、chuA和yjaA擴(kuò)增結(jié)果均為陽性，則繼續(xù)用ArpAgpE基因篩選大腸桿菌所屬群；同時擴(kuò)增trpBA作為內(nèi)部對照，根據(jù)文獻(xiàn)[12]方法判定結(jié)果。

表1 大腸桿菌16S rDNA和系統(tǒng)發(fā)育分群基因的引物序列Table 1 Primers sequences of E. coli 16S-rDNA and phylogenetic grouping genes

1.4 大腸桿菌的耐藥表型檢測

1.4.1 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI-2016版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B(Kirby-Bauer)紙片瓊脂擴(kuò)散法對大腸桿菌進(jìn)行耐藥表型檢測。將菌株分為耐藥(resistance，R)、中介(intermediate，I)和敏感(susceptible，S)[13]3類。

1.4.2 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)表型確認(rèn) 采取雙紙片協(xié)同試驗(yàn)檢測產(chǎn)ESBLs菌株：同時使用頭孢他啶(30 μg)和頭孢他啶/克拉維酸(30/10 μg)及頭孢噻肟(30 μg)和頭孢噻肟/克拉維酸(30/10 μg)2對藥敏紙片，當(dāng)頭孢他啶和頭孢噻肟中有任何一個抑菌環(huán)直徑與加克拉維酸的抑菌環(huán)差值≥5 mm時，即判定為產(chǎn)ESBLs[13]。以大腸桿菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603為質(zhì)控菌。

1.5 大腸桿菌耐藥基因的檢測

1.5.1 引物合成 對具有耐藥表型的菌株進(jìn)行耐藥基因檢測，所檢測的耐藥基因包括抗β-內(nèi)酰胺類藥物的基因(blaCTX-M、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9、blaTEM和blaSHV)、抗四環(huán)素類藥物的基因(tetA、tetG和tetE)、抗氨基糖苷類藥物的基因(aac和aadA1)、抗磺胺類藥物的基因(sul1)和抗氯霉素類藥物的基因(cml1)，其引物序列見表2，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.5.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系與1.2節(jié)相同，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54～69 ℃(具體退火溫度依引物而定，見表2)退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，陽性產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST對比分析確定基因型亞型。

表2 試驗(yàn)檢測的耐藥基因及其引物序列Table 2 Tested genes and there primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 烏魯木齊畜禽肉源大腸桿菌的分離鑒定

從烏魯木齊市7區(qū)19家超市采集的353份新鮮畜禽肉樣中，分離鑒定得到252株大腸桿菌,具體分離結(jié)果如表3所示。由表3可知,天山區(qū)超市采集的畜禽肉樣品中大腸桿菌的分離率最高(90.9%)，經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)超市采集的畜禽肉樣品中大腸桿菌的分離率最低(50.0%)；不同畜禽肉源的大腸桿菌分離率也不同，羊肉源大腸桿菌分離率最高(76.4%)，其次是豬肉源(72.6%)、雞肉源(66.7%)，牛肉源大腸桿菌的分離率最低(65.5%)。

表3 烏魯木齊畜禽肉源大腸桿菌的分離結(jié)果Table 3 Isolation of Escherichia coli from livestock and chicken meat in supermarkets in Urumqi

2.2 烏魯木齊畜禽肉源大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分群

通過多重PCR對252株大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分群，結(jié)果(圖1)顯示，有240株可歸屬為A、B1、D、E和F群，12株為未知分群組。且以A群占優(yōu)勢(79.4%)，B1群次之(12.3%)，而D、E和F群相對較少。此外，B1群在牛肉分離株中的分布數(shù)量最多，豬肉分離株中未知分群組的菌株最多。

2.3 烏魯木齊畜禽肉源大腸桿菌耐藥表型和ESBLs表型確認(rèn)

耐藥表型測定結(jié)果(圖2)顯示，雞肉分離株以1耐和3耐為主，豬肉分離株以3耐和4耐為主，牛肉分離株以5耐為主，羊肉分離株以3耐為主。

圖1 烏魯木齊畜禽肉源大腸桿菌分離株的系統(tǒng)進(jìn)化分群Fig.1 Phylogenetic grouping of E. coli isolates from livestock and chicken meat in supermarkets in Urumqi

由表4可知，252株受試菌株對四環(huán)素(49.6%)、氨芐西林(41.6%)、復(fù)方新諾明(30.9%)和氯霉素(26.6%)的耐藥率較高；對哌拉西林、慶大霉素和鏈霉素的耐藥率分別是20.6%，16.7%，15.5%；對頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、阿莫西林-克拉維酸、左氧氟沙星、氨曲南和頭孢他啶的耐藥率分別是7.9%，7.9%，5.9%，5.5%，4.4%和3.9%；對阿米卡星(1.9%)、多粘菌素B(0.8%)和氨芐西林-舒巴坦(0.4%)的耐藥率較低；對第四代頭孢菌素頭孢吡肟和哌拉西林-他唑巴坦敏感。39株菌為產(chǎn)ESBLs菌株。

表4 烏魯木齊畜禽肉肉源大腸桿菌分離株對18種抗菌藥物耐藥表型的檢測結(jié)果Table 4 Phenotype test of E. coli isolates from livestock and chicken meat sources in Urumqi supermarkets against 18 antimicrobial drugs

表4(續(xù)) Continued table 4

2.4 烏魯木齊畜禽源大腸桿菌耐藥基因的檢測

烏魯木齊畜禽肉源大腸桿菌耐藥基因檢測結(jié)果見表5。由表5可見，125株四環(huán)素類耐藥菌中有113株攜帶tetA基因，其中羊肉源分離株檢出率高達(dá)95.4%，未檢測到tetE和tetG基因。抗β內(nèi)酰胺類藥物的基因中以blaTEM基因?yàn)橹?32.1%)，且均為blaTEM-1；blaCTX-M基因的檢出率為9.2%；blaCTX-M-1基因的檢出率為6.4%，其中有5株亞型為blaCTX-M-55，1株亞型為blaCTX-M-15，1株亞型為blaCTX-M-64；blaCTX-M-9基因的檢出率為3.7%，其亞型均為blaCTX-M-65，其中1株雞源分離株同時攜帶blaCTX-M-55和blaCTX-M-65；未檢測到blaSHV基因。氨基糖苷類耐藥基因中aadA1檢出率(27.4%)高于aac(14.5%)，有4株菌同時攜帶aadA1和aac。cml1和sul1的檢出率分別為31.3%和12.8%。牛肉源分離株均呈aadA1、cml1和sul1陰性；豬肉源分離株均呈blaCTX-M陰性。

表5 烏魯木齊畜禽肉源大腸桿菌耐藥基因檢測結(jié)果Table 5 Genes with E. coli resistance from livestock and chicken meat in Urumqi

3 討論與結(jié)論

3.1 烏魯木齊市不同畜禽肉源大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分群

本研究從烏魯木齊市353份畜禽肉中分離得到252株大腸桿菌，分離率為71.4%，與Zhang等[22]和于慶華[23]研究中畜禽肉源大腸桿菌的分離率接近，提示零售肉受大腸桿菌污染嚴(yán)重，而畜禽在養(yǎng)殖、屠宰加工、運(yùn)輸和銷售各個環(huán)節(jié)都有可能受大腸桿菌污染。A群和B1群主要為共生性大腸桿菌，B2和D群主要為致病性大腸桿菌[24]。Barilli等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在零售肉源大腸桿菌中B2群或D群占總分離菌的39.7%。本研究中零售畜禽肉源大腸桿菌以A群為主，未檢測出B2群，但檢測出少量的D群菌株，這與曾莉[26]的研究結(jié)果相似，表明零售肉可能受到潛在致病性菌株污染。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)加強(qiáng)肉類食品安全的監(jiān)督工作，減少畜禽肉從養(yǎng)殖場到餐桌過程中大腸桿菌的污染，從而降低食源性疾病爆發(fā)的概率。

3.2 烏魯木齊市不同畜禽肉源大腸桿菌的耐藥性

長期使用抗生素可使大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性，耐藥大腸桿菌可在畜禽與周圍環(huán)境之間傳播，并可通過畜禽的皮毛或者腸道內(nèi)容物在屠宰場中進(jìn)一步傳播，導(dǎo)致畜禽源大腸桿菌的耐藥率較高。本研究中，所有受試菌株對四環(huán)素類藥物的耐藥率(49.6%)最高，這可能與四環(huán)素長時間使用、價(jià)格低廉及常作為促生長素與飼料飲水混飼、混飲有一定關(guān)系，亞抑菌濃度抗生素使細(xì)菌更容易產(chǎn)生抗性；其次是β-內(nèi)酰胺類的氨芐西林(41.6%)和磺胺類的復(fù)方新諾明(30.9%)，但耐藥率均低于國內(nèi)外的其他報(bào)道[22,27]。

在分割、包裝和運(yùn)輸中，工作人員操作不當(dāng)或者在售賣過程中可能形成的交叉污染，導(dǎo)致耐藥菌株在畜產(chǎn)品中不斷積累，從而對人類健康以及畜產(chǎn)品安全造成危害。作為廣譜抗生素，β-內(nèi)酰胺類藥物在人醫(yī)和獸醫(yī)臨床治療中常作為首選抑菌藥物，產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要原因。本研究中大腸桿菌分離株對哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率(0.0%)<氨芐西林-舒巴坦(0.4%)<阿莫西林-克拉維酸(5.9%)<哌拉西林(20.6%)<氨芐西林(41.6%)，作為β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，他唑巴坦、舒巴坦和克拉維酸能夠抑制β-內(nèi)酰胺酶并顯著增加抗菌藥物的活力。Badi等[28]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌對阿莫西林-克拉維酸表現(xiàn)出更高的耐藥性，這意味著A群菌株β-內(nèi)酰胺酶可能正在發(fā)生突變或增加亞型多樣性，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的效果逐漸弱化。因此，針對產(chǎn)ESBL大腸桿菌，可將新的β-內(nèi)酰胺復(fù)合類藥物(如頭孢他啶-他唑巴坦)與傳統(tǒng)藥物交替使用，降低其對此類藥物的耐藥性[29]。

氯霉素對人或動物的造血系統(tǒng)可造成不可逆的破壞，因此，我國和大多數(shù)國家已禁止在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用氯霉素。本研究中分離菌株對氯霉素的耐藥率為26.6%，高于Ali等[2]的調(diào)查結(jié)果，這可能是因?yàn)轲B(yǎng)殖戶對禁氯霉素的執(zhí)行力度不夠；也可能是氯霉素的耐藥基因與其他耐藥基因存在基因連鎖現(xiàn)象，在此情況下即使沒有氯霉素的選擇壓力，大腸桿菌仍然能夠表現(xiàn)出氯霉素耐藥表型；還可能是養(yǎng)殖場環(huán)境較差，其他抗氯霉素細(xì)菌通過水平轉(zhuǎn)移將抗性基因轉(zhuǎn)移至大腸桿菌中。

研究表明，豬肉與雞肉源大腸桿菌的高耐藥率更為常見[6]。本研究中豬肉源、雞肉源、羊肉源和牛肉源分離株的耐藥率依次降低。值得注意的是，本研究中羊肉和牛肉源大腸桿菌的耐藥率均高于澳大利亞的羊肉源(2%)和牛肉源(8%)[30]。雞、豬源分離株的高耐藥率與畜禽的養(yǎng)殖方式密不可分，因?yàn)樾陆貐^(qū)的雞、豬以集約化養(yǎng)殖為主，養(yǎng)殖過程中抗生素應(yīng)用頻率更高，而且在極高的養(yǎng)殖密度下活畜禽體表攜帶耐藥大腸桿菌的概率更大。新疆是肉產(chǎn)品消耗大省，從2008起肉類食品消耗量呈穩(wěn)步上升狀態(tài)，市場需求大于供給意味著新疆畜禽養(yǎng)殖將會朝著集約化發(fā)展，逐漸形成完整的養(yǎng)殖、加工、銷售產(chǎn)業(yè)鏈模式，但這種模式會加劇抗生素濫用情況，導(dǎo)致耐藥菌株在生產(chǎn)加工鏈中的傳播更難控制。

細(xì)菌耐藥可分為固有耐藥和獲得性耐藥。耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移是細(xì)菌獲得耐藥性的主要方式之一[31]，本研究通過PCR對耐藥基因進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，烏魯木齊市畜禽肉源大腸桿菌污染情況嚴(yán)重，58.7%的分離株對抗菌藥物產(chǎn)生不同程度的抗性，耐藥基因污染情況嚴(yán)重；其中有23株具有耐藥表型但不攜帶耐藥基因，可能是該類菌株攜帶了不在檢測范圍的其他耐藥基因；84.4%的菌株至少攜帶1種耐藥基因，說明零售畜禽肉可能作為大腸桿菌耐藥基因“儲存庫”，將耐藥基因傳播給其他致病菌或者共生菌。tetA的檢出率最高，說明大腸桿菌對四環(huán)素耐藥主要依靠主動外排泵；編碼ESBL酶的耐藥基因以blaTEM為主，這與國內(nèi)對零售肉源耐藥性調(diào)查結(jié)果[32]一致，但在歐州國家blaCTX-M更為流行，且存在地區(qū)差異[33]。與TEM型的ESBLs酶不同，CTX-M對頭孢噻肟有較強(qiáng)的水解活性，攜帶blaCTX-M的菌株同時攜帶其他耐藥基因的概率更高，且菌株表現(xiàn)為多重耐藥，這可能是因?yàn)榻閷?dǎo)氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素的耐藥基因常和blaCTX-M位于同一質(zhì)粒上，菌株通過耐藥基因連鎖反應(yīng)而獲得耐藥性，這種共同選擇的現(xiàn)象使多重耐藥菌出現(xiàn)概率增高，應(yīng)引起人們的重視。