宋洋 楊仁義 周德生 傅馨瑩 劉利娟 顏思陽(yáng) 陸展輝 陳瑤

摘要 目的：利用GEO芯片數(shù)據(jù)及中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)，獲取氣虛血瘀型腦梗死的差異基因及中醫(yī)藥防治方劑，并分析其作用機(jī)制，為氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治策略提供理論依據(jù)。方法：采用生物信息學(xué)、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等多學(xué)科交叉方法，對(duì)氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治策略進(jìn)行探討。整合基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）、中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（TCMIP）、GeneCards、PubChem、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、STRING、WebGestalt、DAVID多數(shù)據(jù)庫(kù)資源及Cytoscape、R語(yǔ)言軟件工具，對(duì)氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點(diǎn)、中藥靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，從蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)、基因本體（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集的角度，對(duì)中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)數(shù)據(jù)挖掘獲取的氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方的作用機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果：獲取2 542個(gè)氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點(diǎn)，其中差異基因結(jié)果顯示HIF1A、PIK3CA、PIK3R1、TP53、NFKB1、HSP90AA1、CREBBP、CASP8、IL6、TNF、ITGB等表達(dá)上調(diào)，APOE、IGF1、CXCL5、SRC、ADCY5、PTGS2等表達(dá)下調(diào)，可作為疾病診斷治療的潛在靶點(diǎn)。58首氣虛血瘀型腦梗死方劑的用藥規(guī)律，包括頻次、關(guān)聯(lián)及新方組合，獲得氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方劑，由黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實(shí)10味中藥組成，具有益氣活血、行氣化痰的功效，其作用機(jī)制可能與調(diào)控差異基因以多組分、多功能、多途徑的方式，主要通過HIF-1、TNF、NF-kappa B、Apoptosis、PI3K-AKT等通路發(fā)揮作用。結(jié)論：氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治當(dāng)以差異基因靶點(diǎn)為中心，篩選出臨床基礎(chǔ)方，根據(jù)臨床辨證施治加減中藥，同時(shí)可采用多學(xué)科交叉方法對(duì)氣虛血瘀型腦梗死的方劑從多組分、多途徑、多靶點(diǎn)層面進(jìn)行臨床與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究為中醫(yī)藥治療氣虛血瘀型腦梗死提供了方法理論上的指導(dǎo)，對(duì)推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有重要意義。

關(guān)鍵詞 氣虛血瘀;腦梗死;基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù);差異基因;中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

Analysis of Traditional Chinese Medicine Prevention and Treatment Strategy of Cerebral Infarction of Qi Deficiency and Blood Stasis Based on GEO Data and TCM Inheritance Auxiliary System

SONG Yang1，YANG Renyi2，ZHOU Desheng1，F(xiàn)U Xinying2，LIU Lijuan1，YAN Siyang2，LU Zhanhui2，CHEN Yao1

（1 The First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China; 2 Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China）

Abstract Objective：To use GEO chip data and traditional Chinese medicine inheritance auxiliary system to obtain the differential genes and traditional Chinese medicine prevention and treatment prescriptions of cerebral infarction of qi deficiency and blood stasis type，and to analyze its mechanism，so as to provide theoretical basis for the prevention and treatment strategy of traditional Chinese medicine of qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction.Methods：The prevention and treatment strategy of traditional Chinese medicine for cerebral infarction of qi deficiency and blood stasis was discussed by means of bioinformatics，data mining，network pharmacology and other interdisciplinary methods.Integrate GEO，TCMIP，GeneCards，PubChem，TCMSP，String，WebGestalt，DAVID multi-database resources and Cytoscape，R language software tools to screen disease targets and traditional Chinese medicine targets of qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction.From the point of view of PPI network，GO and KEGG enrichment，the mechanism of the basic side of qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction obtained by data mining of TCM inheritance auxiliary system were discussed.Results：A total of 2542 disease targets of cerebral infarction with qi deficiency and blood stasis were obtained.The results of differential genes showed that the expressions of HIF1A，PIK3CA，PIK3R1，TP53，NFKB1，HSP90AA1，CREBBP，CASP8，IL6，TNF and ITGB were up-regulated，while the expressions of APOE，IGF1，CXCL5，SRC，ADCY5 and PTGS2 were down-regulated，which can be used as potential targets for disease diagnosis and treatment.A total of 58 the medication rule of the first qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction prescription，including frequency，correlation and new prescription combination，to obtain the basic prescription of qi deficiency and blood stasis type of cerebral infarction，which is composed of Astragali Radix，Ligusticum chuanxiong Hort，Angelica sinensis （Oliv.） Diels，Pheretima，Codonopsis Radix，Panacis Quinquefolii Radix，Atractylodes macrocephala Koidz，Persicae Semen，Paeoniae Rubra Radix，Aurantii Immaturus Fructus，which have the effect of replenishing qi and activating blood circulation，promoting qi and resolving phlegm，and its action mechanism may be related to the regulation of differential genes in a multi-component，multi-functional and multi-channel way.It plays a role mainly through HIF-1，TNF，NF-kappaB，Apoptosis，PI3K-AKT and other pathways.Conclusion：The prevention and treatment of cerebral infarction of qi deficiency and blood stasis type by traditional Chinese medicine should focus on the target of different genes，select the clinical basic prescription，and add or subtract traditional Chinese medicine according to clinical syndrome differentiation.At the same time，multi-disciplinary interdisciplinary method can be used to verify the clinical and experimental results of traditional Chinese medicine in the treatment of qi deficiency and blood stasis cerebral infarction from multi-component，multi-pathway and multi-target levels.This study provides theoretical guidance for the treatment of qi deficiency and blood stasis cerebral infarction with traditional Chinese medicine.It is of great significance to promote the modernization of traditional Chinese medicine.

Keywords Qi deficiency and blood stasis; Cerebral infarction; GEO; Differential gene; Inheritance assistant system of traditional Chinese medicine; Network pharmacology

中圖分類號(hào)：R285;R242文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.008

腦梗死屬中醫(yī)“缺血中風(fēng)”范疇[1]，是老年人常見病與多發(fā)病，被歷代醫(yī)家視作“風(fēng)勞鼓膈”四大難證之首。腦梗死發(fā)病率、致殘率排名世界第一，現(xiàn)已超過癌癥，成為我國(guó)首位死亡因素[2]。氣虛血瘀是腦梗死的關(guān)鍵病機(jī)[3]，歷代醫(yī)家以氣虛血瘀這一病理因素，結(jié)合益氣活血治法，創(chuàng)制了大量臨床有效的方劑（如補(bǔ)陽(yáng)還五湯），為中醫(yī)藥防治腦梗死疾病做出了巨大貢獻(xiàn)。在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐過程中，益氣活血治法理論指導(dǎo)下的益氣、活血中藥種類繁多且作用機(jī)制尚不明確，因此精準(zhǔn)篩選新方并探討其潛在作用機(jī)制，對(duì)提高療效至關(guān)重要。隨著現(xiàn)代科學(xué)及計(jì)算機(jī)算法的不斷發(fā)展，本研究整合基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）芯片數(shù)據(jù)，同時(shí)應(yīng)用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)[4]，探討氣虛血瘀型腦梗死的潛在靶點(diǎn)及中醫(yī)藥防治組方規(guī)律，并對(duì)中醫(yī)藥防治氣虛血瘀型腦梗死的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)分析，為臨床開發(fā)新藥提供理論及實(shí)踐依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 氣虛血瘀型腦梗死疾病的靶點(diǎn)篩選

通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）子數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Cerebral infarction”為檢索詞，獲取GSE100235數(shù)據(jù)集，下載sham組與QDBS/MCAO（QXXY）組大鼠基因芯片數(shù)據(jù)。采用R語(yǔ)言對(duì)正常組，即sham組（GSM2675543、GSM2675544、GSM2675545）;氣虛血瘀型腦梗死組，即QDBS/MCAO組（GSM2675546、GSM2675547、GSM2675548）進(jìn)行差異性分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理及主成分分析，并繪制箱式圖與主成分分析圖，以logFC≥1與adj.P.Val<0.05為差異基因篩選條件，篩選出氣虛血瘀型腦梗死的靶點(diǎn)，并繪制火山圖。

通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP）[5]（http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html）數(shù)據(jù)庫(kù)，采用“整合藥理學(xué)分析工具集合”中證型靶點(diǎn)分析工具，以“反向篩選”為方式，檢索并導(dǎo)出“氣虛血瘀證”相關(guān)靶點(diǎn)。同時(shí)通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，以“Cerebral infarction”為檢索詞，檢索并導(dǎo)出“腦梗死”疾病相關(guān)靶點(diǎn)。繪制“氣虛血瘀證”與“腦梗死”相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖，交集獲得氣虛血瘀型腦梗死的靶點(diǎn)。

取GEO數(shù)據(jù)庫(kù)與GeneCards、TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲取的氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點(diǎn)的并集，采用Excel去除重復(fù)值保留唯一值，最終獲取整合后氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點(diǎn)。

1.2 氣虛血瘀型腦梗死方劑組方規(guī)律及基礎(chǔ)方探討

檢索國(guó)家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(kù)（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）中收錄的氣虛血瘀型腦梗死的方劑，采用中醫(yī)傳統(tǒng)輔助平臺(tái)系統(tǒng)中數(shù)據(jù)挖掘功能，以分析其用藥規(guī)律。

方劑來源：以“腦梗死”“氣虛血瘀”“缺血性中風(fēng)”“缺血性腦卒中”“缺血中風(fēng)”“缺血卒中”為檢索詞，在CNKI中獲取氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)有效方劑。

方劑篩選：1）符合公認(rèn)的氣虛血瘀型腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn);2）納入中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合治療氣虛血瘀型腦梗死的文獻(xiàn)、醫(yī)案、思想研究所提供的方藥;3）排除慢性繼發(fā)性疾?。ㄈ缣悄虿。┑纫鹉X梗死的文獻(xiàn)，排除資料不完整、無明確藥物組成或藥物不全的文獻(xiàn)。

錄入及分析：采用中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)（V2.5）錄入上述方劑，參照《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)中藥藥名進(jìn)行歸一化處理，由雙人審核以確保數(shù)據(jù)錄入準(zhǔn)確性。采用“數(shù)據(jù)-方劑”分析功能對(duì)方劑藥物頻次統(tǒng)計(jì)、組方規(guī)律進(jìn)行分析，并篩選出氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)防治新方劑，即為氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治基礎(chǔ)方。

1.3 氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點(diǎn)篩選

基于中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)頻次統(tǒng)計(jì)、關(guān)聯(lián)分析及熵層次聚類分析，同時(shí)結(jié)合新方劑中各中藥功效主治及益氣活血治法，篩選出黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實(shí)10味中藥作為防治氣虛血瘀型腦梗死的基礎(chǔ)方。

氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方有效成分收集：1）利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[6]（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以人體藥代動(dòng)力學(xué)ADMT[7]參數(shù)中口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%;藥物類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為條件，獲取黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實(shí)10味中藥有效成分。2）通過PubChem[8]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)收集各有效成分SDF結(jié)構(gòu)式。

氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點(diǎn)收集：通過Swiss Target Prediction[9]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)，將有效成分導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點(diǎn)。

將材料與方法1.1中氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點(diǎn)（以下稱：疾病靶點(diǎn)）與氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點(diǎn)（以下稱：中藥靶點(diǎn)）取交集，獲取氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治靶點(diǎn)（以下稱：防治靶點(diǎn)），并繪制韋恩圖。

1.4 氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將防治靶點(diǎn)導(dǎo)入String[10]（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定模式為“Multiple Protenin”、物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)信息，同時(shí)采用Cytoscape軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化及Degree、Betweenness、Closeness算法拓?fù)浞治觥?/p>

1.5 防治靶點(diǎn)基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

采用WebGestalt[11]（http：//www.webgestalt.org/#）數(shù)據(jù)庫(kù)，采用ORA（Over-Representation Analysis，ORA）算法，將防治靶點(diǎn)導(dǎo)入，進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，收集生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細(xì)胞成分（Cell Component，CC）、KEGG富集分析數(shù)據(jù)，同時(shí)進(jìn)行權(quán)重分析，并繪制火山圖[12]。

采用DAVID[13]（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)防治靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)合校正P值及文獻(xiàn)報(bào)道選取氣虛血瘀型常用通路與防治靶點(diǎn)關(guān)系，并繪制弦圖，以進(jìn)一步對(duì)防治靶點(diǎn)與通路進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 氣虛血瘀型腦梗死疾病的靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過GEO數(shù)據(jù)集，采用R語(yǔ)言affyPLM與limma包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行歸一化及差異分析，并繪制箱式圖（、主成分分析圖及火山圖。對(duì)差異基因進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換及K最近鄰（K-Nearest Neighbor，KNN）法補(bǔ)充缺失值后，共篩選出2 080個(gè)氣虛血瘀型腦梗死相關(guān)靶點(diǎn)，其中1 817個(gè)表達(dá)上調(diào)（如：SAMD9L、CAST、IGSF6、HIF-1A等），263個(gè)表達(dá)下調(diào)（如APOE、FGG、IGF1等）。見圖1A～C。

通過TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)證型檢索與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)疾病檢索，結(jié)合韋恩圖分析，獲取數(shù)據(jù)庫(kù)中氣虛血瘀型腦梗死相關(guān)靶點(diǎn)共543個(gè)（如：AKT1、APP、JUN、VEGFA等）。采用Excel軟件去除重復(fù)值保留唯一值，整合GEO芯片數(shù)據(jù)及GeneCards、TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲取的氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點(diǎn)共2 542個(gè)。見圖2。

2.2 氣虛血瘀型腦梗死方劑組方規(guī)律及基礎(chǔ)方探討

2.2.1 中藥頻次統(tǒng)計(jì)結(jié)果

本研究共納入58首方劑，含中藥95味，采用“頻次統(tǒng)計(jì)”方法，得到頻次≥9次的中藥共16味，位列前3的分別為黃芪、川芎、當(dāng)歸。見表1。

2.2.2 氣虛血瘀型腦梗死組方規(guī)律關(guān)聯(lián)分析結(jié)果? 采用關(guān)聯(lián)規(guī)則分析方法，支持度=11，獲取常用中藥藥對(duì)、藥串共243組，其中有42組頻次≥25;繪制關(guān)聯(lián)分析網(wǎng)絡(luò)圖。見表2，圖3。

2.2.3 氣虛血瘀型腦梗死熵層次聚類新方分析結(jié)果

采用“新方分析”，相關(guān)度=8，懲罰度=3，基于核心組合進(jìn)行熵層次聚類分析，獲得3味藥核心組合17個(gè);藥物組合聚合成新方，形成氣虛血瘀型腦梗死的5個(gè)新方，處方1：全蝎，蜈蚣，赤芍，桃仁，白芍，丹參，三七;處方2：桃仁，當(dāng)歸，赤芍，枳實(shí)，白術(shù);處方3：川芎，黨參，西洋參，黃芪;處方4：牛膝，甘草，木瓜，枳實(shí);處方5：黃芪，地龍，西洋參，白術(shù)，繪制網(wǎng)絡(luò)展示圖。見表3，圖4。

2.3 氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方中藥潛在靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

共獲取904個(gè)中藥靶點(diǎn)，將疾病靶點(diǎn)與中藥靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩圖分析，獲取防治靶點(diǎn)共314個(gè)（如HIF1A、BCL2、JAK1等）。見圖5A。

PPI網(wǎng)絡(luò)中共314個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 306條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為8.32，平均聚類系數(shù)為0.49，P值<1.0e-16，根據(jù)PPI次數(shù)（即：Degree值）多少設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小，Degree值越大節(jié)點(diǎn)越大。見圖5B。Degree、Closeness、Betweenness算法前20靶點(diǎn)結(jié)果見表4，拓?fù)浞治鼋Y(jié)果見圖5C～E。

2.4 氣虛血瘀型腦梗死防治靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析結(jié)果 通過WebGestalt與DAVID數(shù)據(jù)集對(duì)防治靶點(diǎn)進(jìn)行BP、CC、MF、KEGG分析，BP結(jié)果顯示，314個(gè)防治靶點(diǎn)富集于468個(gè)生命進(jìn)程，主要與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控等有關(guān);CC結(jié)果顯示，314個(gè)防治靶點(diǎn)富集于29個(gè)細(xì)胞組分，主要與膜區(qū)、突觸膜、受體復(fù)合物等有關(guān);MF結(jié)果顯示，314個(gè)防治靶點(diǎn)富集于77個(gè)分子功能，主要與神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、銨離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子與受體DNA結(jié)合調(diào)控等有關(guān);KEGG結(jié)果顯示，314個(gè)防治靶點(diǎn)富集于166個(gè)信號(hào)通路，主要與神經(jīng)活性受體-配體相互作用通路、HIF-1信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等有關(guān)。見圖6A～D。

對(duì)KEGG富集信號(hào)通路結(jié)果進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析，篩選出P<0.05的常見氣虛血瘀型腦梗死信號(hào)通路12條，整合Degree、Closeness、Betweenness算法前20防治靶點(diǎn)，刪除無通路對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)并保留唯一靶點(diǎn)后，根據(jù)通路與靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制“防治靶點(diǎn)-通路”弦圖，以尋找12條常見通路中富集的防治靶點(diǎn)。見圖6E。

3 討論

腦梗死是臨床常見病、多發(fā)病，氣虛血瘀型腦梗死理論源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展與氣血相關(guān)，氣血虧虛，血流無力，氣凝血滯，瘀阻腦絡(luò)，發(fā)為中風(fēng)，故而半身不遂，發(fā)為偏枯。清代王清任基于氣虛血瘀理論辨治腦梗死，創(chuàng)立經(jīng)典的補(bǔ)陽(yáng)還五湯，奠定了臨床氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治的理論實(shí)踐基礎(chǔ)。歷代醫(yī)家認(rèn)為氣虛血瘀是腦梗死的重要病機(jī)，同時(shí)整合臨床實(shí)踐創(chuàng)立了大量的氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治的方劑，如當(dāng)歸補(bǔ)血湯、清陽(yáng)湯等臨床常用方劑，但辨證論治理論指導(dǎo)下的臨床加減及客觀化相對(duì)局限，作用機(jī)制尚不明確，因此精準(zhǔn)篩選氣虛血瘀型腦梗死疾病的中醫(yī)藥防治基礎(chǔ)方，并探討其作用機(jī)制具有重要意義。

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)收集了大量微陣列芯片數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)方法，分析疾病差異表達(dá)基因譜，為疾病防治提供基因靶點(diǎn)，是靶點(diǎn)分析常用數(shù)據(jù)庫(kù)之一。中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)以數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰹榛A(chǔ)，能對(duì)中醫(yī)藥原始數(shù)據(jù)進(jìn)行二次的聚類熵層次分析，以關(guān)聯(lián)方式篩選出新的方劑。本研究綜合GEO芯片、TCMIP、GeneCards等多數(shù)據(jù)庫(kù)資源，采用生物信息學(xué)方法，篩選出氣虛血瘀型腦梗死的差異基因，為臨床診斷及防治提供了靶點(diǎn)依據(jù)。同時(shí)采用中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)對(duì)氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治方劑進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘及規(guī)律分析，篩選出臨床基礎(chǔ)方，為氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治提供藥物依據(jù)。最后關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)與藥物分析結(jié)果，通過GO與KEGG富集分析，初步探討氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治基礎(chǔ)方的作用機(jī)制。

本研究通過GEO、TCMIP、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取2 542個(gè)氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點(diǎn)，其中差異基因結(jié)果顯示HIF1A、PIK3CA、PIK3R1、TP53、NFKB1、HSP90AA1、CREBBP、CASP8、IL6、TNF、ITGB等表達(dá)上調(diào)，APOE、IGF1、CXCL5、SRC、ADCY5、PTGS2等表達(dá)下調(diào)，能在氣虛血瘀型腦梗死疾病中差異表達(dá)，可作為疾病診斷治療的潛在靶點(diǎn)。已有研究證實(shí)，益氣活血理論指導(dǎo)下的方劑、中藥、有效成分能通過調(diào)控差異基因，在氣虛血瘀型腦梗死疾病的防治中發(fā)揮重要作用。張芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)益氣活血治法立方的益血方能上調(diào)HIF1A與Ang-2表達(dá)，促進(jìn)腦梗死后血管新生，從而改善腦梗死后腦組織損傷。付蓓蓓等[15]研究發(fā)現(xiàn)益氣中藥黃芪中主要有效成分黃芪甲苷能降低白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、核因子κB等分子表達(dá)水平，改善腦梗死后炎癥反應(yīng)，促進(jìn)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，基于GEO等數(shù)據(jù)庫(kù)差異分析的氣虛血瘀型腦梗死疾病靶點(diǎn)，可為氣虛血瘀型腦梗死證型、疾病、診斷、治療提供潛在靶點(diǎn)，為后續(xù)臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

本研究基于中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)分析了58首氣虛血瘀型腦梗死方劑的用藥規(guī)律，包括頻次、關(guān)聯(lián)及新方組合。中藥頻次分析結(jié)果以活血化瘀藥、補(bǔ)虛藥為主，如川芎、紅花、桃仁、丹參、三七、雞血藤活血化瘀，黃芪、當(dāng)歸、黨參、甘草補(bǔ)虛，兼以全蝎、地龍平肝熄風(fēng)，桂枝解表，赤芍清熱等，因此氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治當(dāng)以益氣補(bǔ)虛、活血化瘀為主，隨證加減可增強(qiáng)其療效。其中中藥頻次結(jié)果中最高的3味中藥依次為黃芪、川芎及當(dāng)歸，藥對(duì)、藥串頻次結(jié)果中補(bǔ)氣-活血的藥對(duì)、藥串為多，如桃仁、黃芪，黃芪、水蛭，桃仁、黃芪、地龍，桃仁、黃芪、當(dāng)歸，黃芪、當(dāng)歸、地龍。單純活血化瘀的藥對(duì)、藥串頻次也較高，如桃仁、當(dāng)歸，川芎、紅花、當(dāng)歸。新方聚類藥物組合中，亦以活血化瘀與補(bǔ)虛為基礎(chǔ)，類似中風(fēng)經(jīng)方如補(bǔ)陽(yáng)還五湯、桃紅四物湯。同時(shí)分析其他治療原則包括：開竅、化痰、滋補(bǔ)肝腎、健脾除濕等功效，提示方藥并非全以補(bǔ)氣活血為主，同時(shí)配伍呈現(xiàn)出多樣性，如處方1以活血開竅藥物組合為主，處方2以理氣活血藥物組合為主，處方4以化痰活血通絡(luò)藥物組合為主?？梢?，活血化瘀、補(bǔ)氣在中風(fēng)氣虛血瘀證中極其重要，臨證選擇以益氣活血為主法，同時(shí)輔以開竅、清熱、解表、化痰等治法。

腦梗死屬于中醫(yī)“缺血中風(fēng)”范疇，《醫(yī)林改錯(cuò)》云：“人過半百元?dú)庖烟?，氣虛無力推動(dòng)血行，使之瘀血偏滯于體，乃罹患偏癱?！碧岢鰵馓撗鰧W(xué)說。中老年人，臟腑虧虛，或久病體虛，氣虛無力，氣行則血運(yùn)，氣虛則血瘀，瘀阻腦絡(luò)而不通，腦竅失養(yǎng)，發(fā)為中風(fēng);陰血虧虛，陰陽(yáng)失衡，陰無以制陽(yáng)，虛陽(yáng)上浮，肝陽(yáng)上亢，肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)，瘀血、痰濁隨風(fēng)而動(dòng)，阻滯腦竅，發(fā)為中風(fēng)，故氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治當(dāng)以益氣活血為主，輔以行氣、化痰、通絡(luò)的中藥，整合本研究頻次、關(guān)聯(lián)及新方結(jié)果，提出黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實(shí)10味中藥可作為氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治的基礎(chǔ)方，方中黃芪、川芎、當(dāng)歸為君，行益氣、活血化瘀之功;地龍、黨參、西洋參為臣，主以通絡(luò)、益氣生津之效;桃仁、赤芍為佐，輔以活血、行氣化瘀之功;白術(shù)、枳實(shí)為使，配以祛濕、行氣化痰之效，共奏益氣活血、行氣化痰之功效，為氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治提供了藥物治療方案。

為進(jìn)一步探討氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方在中醫(yī)藥防治中的作用機(jī)制，本研究整合TCMSP、Swiss Target Prediction、String、WebGestalt、DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出基礎(chǔ)方的中藥靶點(diǎn)，取中藥靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)獲取共同的防治靶點(diǎn)，并對(duì)防治靶點(diǎn)進(jìn)行PPI、GO、KEGG作用機(jī)制探討，結(jié)果顯示共有314個(gè)防治靶點(diǎn)在氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方防治中發(fā)揮作用。結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)Degree、Closeness、Betweenness算法拓?fù)浞治鼋Y(jié)果提示，其防治作用主要與APP、PIK3CA、PIK3R1、TP53、CASR、SRC、AKT1、ADCY5、ADCY1、MAPK3、NFKB1、HSP90AA1、JUN、VEGFA、NR3C1、CASP8、IL6、TNF等靶點(diǎn)有關(guān)。結(jié)合GO和KEGG富集分析結(jié)果提示其防治作用機(jī)制：主要在膜區(qū)、突觸膜、受體復(fù)合物等細(xì)胞組分，發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、銨離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子與受體DNA結(jié)合調(diào)控等分子功能，通過神經(jīng)活性受體-配體相互作用通路、HIF-1信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等，參與蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)節(jié)、白細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控等生命進(jìn)程。

整合氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，結(jié)合“防治靶點(diǎn)-通路”弦圖分析，12條氣虛血瘀型腦梗死常見通路與前20個(gè)防治靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，如HIF-1信號(hào)通路中主要富集PIK3CA、PIK3R1、AKT1、MAPK3、NFKB1、CREBBP、VEGFA、IL6;TNF信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、Apoptosis信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路靶點(diǎn)富集結(jié)果如弦圖所示。以HIF-1信號(hào)通路為例，進(jìn)一步結(jié)合GEO芯片數(shù)據(jù)差異基因分析結(jié)果，可初步得出氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方能通過上調(diào)HIF1A（HIF-1α）、PIK3CA（PI3K）、PIK3R1、NFKB1（NF-κB）、CREBBP、IL6、TNF等靶點(diǎn)，下調(diào)APOE、IGF1、CXCL5、SRC、ADCY5、PTGS2等靶點(diǎn)，從而在氣虛血瘀型腦梗死疾病中發(fā)揮作用。已有研究證實(shí)在益氣活血理論指導(dǎo)下的方劑，如復(fù)方景川片[16]能上調(diào)HIF1A表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善腦缺血損傷;益氣通脈湯[17]輔助西醫(yī)綜合干預(yù)在腦梗死急性期能調(diào)控HIF1A與TNF靶點(diǎn)水平，改善缺血區(qū)腦血流灌注障礙，降低急性腦梗死患者神經(jīng)功能損傷，改善患者認(rèn)知水平及昏迷狀態(tài)。陳博威等[18]采用Cav-1基因敲除小鼠證實(shí)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能通過上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)氣虛血瘀型腦梗死小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方可能通過調(diào)控差異基因，以多組分、多功能、多途徑的方式，主要通過HIF-1、TNF、NF-kappa B、Apoptosis、PI3K-AKT等通路發(fā)揮作用，為進(jìn)一步探討氣虛血瘀型腦梗死的中醫(yī)藥防治提供了通路機(jī)制理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究分析GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中氣虛血瘀型腦梗死芯片數(shù)據(jù)，篩選出差異基因（如：HIF1A、PIK3CA、TP53等上調(diào)，APOE、IGF1、CXCL5等下調(diào)），為診斷及治療提供靶點(diǎn)依據(jù)。同時(shí)基于中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)對(duì)氣虛血瘀型腦梗死中醫(yī)藥防治方劑進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘及規(guī)律分析，篩選出臨床基礎(chǔ)方，由黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、黨參、西洋參、白術(shù)、桃仁、赤芍、枳實(shí)10味中藥組成，具有益氣活血、行氣化痰之功效。最后對(duì)氣虛血瘀型腦梗死基礎(chǔ)方進(jìn)行作用機(jī)制預(yù)測(cè)分析，得出其可能通過調(diào)控防治靶點(diǎn)（如HIF1A、NF-κB、PI3K、IL6、TNF等），以多組分、多功能、多途徑的形式，介導(dǎo)HIF-1、TNF、NF-kappa B、Apoptosis、PI3K-AKT等信號(hào)通路在氣虛血瘀型腦梗死疾病中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

[1]周韓，周德生，劉利娟，等.缺血中風(fēng)榮氣虛滯病機(jī)源流[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2019，34（9）：1844-1849.

[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018[J].中華神經(jīng)科雜志，2018，51（9）：666-682.

[3]王燕珍，王維峰，安玉蘭，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯合四君子湯加減治療中風(fēng)后疲勞氣虛血瘀證和抗氧化及抗炎的作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2020，26（23）：131-136.

[4]盧朋，李健，唐仕歡，等.中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)軟件開發(fā)與應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（9）：1-4.

[5]Xu HY，Zhang YQ，Liu ZM，et al.ETCM：an encyclopaedia of traditional Chinese medicine[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D976-D982.

[6]Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6：13.

[7]Zhang W，Chen Y，Jiang H，et al.Integrated strategy for accurately screening biomarkers based on metabolomics coupled with network pharmacology[J].Talanta，2020，211：120710.

[8]Kim S，Chen J，Cheng T，et al.PubChem 2019 update：improved access to chemical data[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D1102-D1109.

[9]Gfeller D，Michielin O，Zoete V.Shaping the interaction landscape of bioactive molecules[J].Bioinformatics，2013，29（23）：3073-3079.

[10]Szklarczyk D，Gable AL，Lyon D，et al.STRING v11：protein-protein association networks with increased coverage，supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D607-D613.

[11]Liao Y，Wang J，Jaehnig EJ，et al.WebGestalt 2019：gene set analysis toolkit with revamped UIs and APIs[J].Nucleic Acids Res，2019，47（W1）：W199-W205.

[12]世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì).網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南[J].世界中醫(yī)藥，2021，16（4）：527-532.

[13]Jiao X，Sherman BT，Huang da W，et al.DAVID-WS：a stateful web service to facilitate gene/protein list analysis[J].Bioinformatics，2012，28（13）：1805-1806.

[14]張芳，張波，錢發(fā)才.益血方對(duì)急性腦梗死大鼠血管新生的作用及對(duì)促血管生成因子HIF-1α和Ang-2表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2019，28（6）：1007-1010.

[15]付蓓蓓，鄭永強(qiáng)，徐悅.黃芪甲苷改善大鼠急性腦梗死神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能及對(duì)梗死側(cè)大腦皮層中NF-κB p65及IKKβ蛋白的影響[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2019，28（1）：25-28.

[16]張巖，劉慶煥，王宏，等.復(fù)方景川片調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)對(duì)大鼠缺血性腦損傷的保護(hù)作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2019，34（12）：3506-3511.

[17]哈玲梅，楊麗榮，張賽，等.疏血通注射液聯(lián)合阿替普酶治療急性缺血性腦卒中的效果及對(duì)血液流變學(xué)的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥，2020，15（3）：378-382.

[18]陳博威，周勝?gòu)?qiáng)，易健，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)Cav-1～（-/-）小鼠腦缺血模型PI3K、Akt、PTEN表達(dá)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2020，27（4）：35-40.

（2020-05-19收稿 責(zé)任編輯：楊燕）