張亞杰，徐金帥，鄒 波，李思含，李春美,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，教育部環(huán)境食品學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州 510000）

柚皮苷（Naringin）和檸檬苦素（Limonin）廣泛存在于柚皮中，是最主要的黃酮和三萜類物質(zhì)。近年來(lái)，眾多研究表明柚皮苷和檸檬苦素具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抑菌、抗氧化、心血管疾病預(yù)防、干預(yù)骨質(zhì)疏松等活性[1?6]，在食品、醫(yī)藥以及化妝品等領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。但其化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，在加工處理過(guò)程中結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化，甚至失去活性。有研究報(bào)道柚皮苷溶液在放置5 h后吸光值發(fā)生顯著的變化[7]。而檸檬苦素在不同的pH、溫度、與光照和氧氣接觸的時(shí)長(zhǎng)都會(huì)發(fā)生不同程度的變化[8]。在45~90 ℃之間，降解速率會(huì)加快；在外界環(huán)境中暴露時(shí)間越久，生物活性越弱。不僅如此，柚皮苷和檸檬苦素是柚皮中最主要的苦味成分，其中柚皮苷和檸檬苦素的苦味閾值分別為20 mg/L[9]和6 mg/L[10]，導(dǎo)致其很難被人們接受，限制了在食品中的應(yīng)用。

微膠囊技術(shù)一般采用天然或合成的高分子作為包囊材料，通過(guò)各種不同的成膜反應(yīng)形成一種連續(xù)的薄膜，將一些分散成細(xì)小的、具有反應(yīng)活性、敏感或易揮發(fā)的固體小顆粒、小液滴、甚至氣體小分子包覆起來(lái)，形成一種具有半透性或密封性的囊形結(jié)構(gòu)，即微膠囊[11]。在眾多的微膠囊制備方法中，銳孔造粒法因其良好的包埋率、載藥率及操作簡(jiǎn)便而受到廣泛的應(yīng)用及研究[12]。黃酮類和三萜類物質(zhì)吸收和代謝的場(chǎng)所主要是在小腸[13?14]，這意味著柚皮苷和檸檬苦素必須減少在胃中的釋放，因此，具有pH敏感性的海藻酸凝膠微粒在控制芯材的釋放中發(fā)揮了不可或缺的作用?，F(xiàn)今在微膠囊技術(shù)領(lǐng)域研究最多也是最成熟的微膠囊體系是以海藻酸鈉和聚賴氨酸為壁材的微膠囊，但其制備工藝復(fù)雜，選用材料中聚賴氨酸成本高且難獲取，大大局限了該種微膠囊的推廣及應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，海藻酸鹽和殼聚糖之間的結(jié)合比聚賴氨酸和海藻酸鹽之間的結(jié)合顯著增強(qiáng)，而且殼聚糖與聚賴氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)較為相近，同時(shí)殼聚糖生物相容性好和易獲取，被認(rèn)為是聚賴氨酸的理想替代材料[15]。

因此，微膠囊技術(shù)具有保護(hù)芯材，控制芯材釋放的同時(shí)降低或掩蓋不良味道及延長(zhǎng)保質(zhì)期等優(yōu)勢(shì)[16?18]。且目前對(duì)柚皮苷和檸檬苦素微膠囊的研究鮮有報(bào)道。本文擬分別用海藻酸鈉-殼聚糖-氯化鈣作為微膠囊壁材對(duì)柚皮苷和檸檬苦素同時(shí)進(jìn)行包埋，通過(guò)傅里葉紅外光譜儀（FT-IR）和掃描電鏡（SEM）分析、體外模擬胃腸消化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)微膠囊化的柚皮苷和檸檬苦素可有效避開(kāi)胃酸的侵害，在小腸內(nèi)充分釋放，有利于發(fā)揮其生理功能，提高生物利用率和轉(zhuǎn)化率，以期為開(kāi)發(fā)降糖、降脂食品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柚皮苷和檸檬苦素 純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司；海藻酸鈉和殼聚糖 食品級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶（純度為1:15000）、胰酶（純度為1:4000） 上海源葉生物科技有限公司。

Multiskan FC多功能酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司；85-2磁力攪拌器 常州朗越儀器制造有限公司；pH計(jì) 上海捷萊科化工科技有限公司；Nicolet Nexus 470傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司；掃描電鏡（JSM-6390LV） 日本NTC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照先前的方法[19]，用70%乙醇配制2 mg/mL柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別吸取0.8、0.6、0.4、0.2、0.1和0.05 mL標(biāo)準(zhǔn)液至6個(gè)4 mL EP管，再分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、0.9和0.95 mL 70%乙醇，配制成1.6、1.2、0.8、0.4、0.2和0.1 mg/mL的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)液。各取0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)液，5 mL 90%一縮二乙二醇溶液，0.1 mL 4 mol/L NaOH溶液，4.7 mL去離子水，漩渦振蕩5 s后置于40 ℃水浴中保溫10 min，420 nm下測(cè)其吸光值，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定三次并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得柚皮苷的回歸方程y=0.1487x?0.003111，R2=0.9996。

1.2.2 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用無(wú)水乙醇配制0.2 mg/mL檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品溶液；顯示劑A液：125 mg對(duì)二甲氨基苯甲醛溶于100 mL的硫酸和乙醇混合液中（硫酸:無(wú)水乙醇=65:35（V:V）），放冷使用；顯示劑B液：準(zhǔn)確稱取FeCl30.9 g，蒸餾水溶解并定容至10 mL；使用時(shí)向A液中加入0.5 mL B液；

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.125、0.25、0.5、1和2 mL檸檬苦素溶液，無(wú)水乙醇定容至2 mL，最后加入5 mL顯色劑，振蕩2 s，靜置，30 min后490 nm下測(cè)其吸光度值，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得檸檬苦素的回歸方程y=4.421x?0.04549，R2=0.9954。

1.2.3 微膠囊的制備 銳孔法制備柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的具體操作步驟：稱取一定量海藻酸鈉60 ℃下加入去離子水邊攪拌邊溶解；向攪拌均勻的海藻酸鈉溶液中加入一定量的柚皮苷和檸檬苦素，繼續(xù)用磁力攪拌器攪拌均勻；將一定量的殼聚糖溶解于1%冰醋酸溶液，再加一定量氯化鈣溶液，并用20% NaOH調(diào)pH，攪拌均勻；最后將柚皮苷與海藻酸鈉混懸液用一定規(guī)格的注射器以一定速率加入到殼聚糖-氯化鈣溶液中（300 r/min）攪拌，固化15 min，待微膠囊成形；抽濾收集，將制備成形的微膠囊置于凍干機(jī)中冷凍干燥，得到微膠囊成品。

1.2.4 微膠囊包埋率的測(cè)定 取1.2.3制備的濕囊，加入100 mL 70%乙醇均質(zhì)10 min，抽濾，準(zhǔn)確定容至100 mL，分別對(duì)柚皮苷和檸檬苦素進(jìn)行檢測(cè)，以測(cè)得的檸檬苦素和柚皮苷的總含量（mg/mL）為被包埋芯材的含量，再按照公式得出此微膠囊對(duì)包埋率。

1.2.5 確定適合的檸檬苦素與柚皮苷的比例 固定氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，pH為5.5，芯壁材比為1:2；設(shè)置檸檬苦素和柚皮苷的比例分別為1:1、1:2、2:5、1:5和1:10，總含量為0.15 g，然后測(cè)定包埋率。

1.2.6 確定適合的pH 固定檸檬苦素與柚皮苷的比例為1:5，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，芯壁材比為1:2；柚皮苷和檸檬苦素0.15 g，設(shè)置不同的pH為：3、4、5、6和7，然后測(cè)定包埋率。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.7.1 不同壁芯材比對(duì)柚皮苷和檸檬苦素包埋率的影響 固定檸檬苦素與柚皮苷的比例為1:5，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，pH為6；柚皮苷和檸檬苦素0.15 g，設(shè)置不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%，即壁芯材比為2:3、4:3、2:1、8:3和10:3，然后測(cè)定包埋率。

1.2.7.2 不同殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷和檸檬苦素包埋率的影響 固定檸檬苦素與柚皮苷的比例為1:5，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，pH為6，芯壁材比為1:2，柚皮苷和檸檬苦素0.15 g，設(shè)置不同的殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%，然后測(cè)定包埋率。

1.2.7.3 不同氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷和檸檬苦素包埋率的影響 固定檸檬苦素與柚皮苷的比例為1:5，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，pH為6，芯壁材比為1:2，柚皮苷和檸檬苦素0.15 g，設(shè)置不同的氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%和5%，然后測(cè)定包埋率。

1.2.8 響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化微膠囊制備的工藝條件在1.2.7單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)包埋率影響較大的芯壁材比、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氯化鈣分?jǐn)?shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-Expert-8.0.6軟件中的響應(yīng)面設(shè)計(jì)（Box-Behnken Design，BBD）進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 1 Response surface factors and levels

1.2.9 FT-IR分析 將空微膠囊、載柚皮苷和檸檬苦素微膠囊粉末壓片，采用傅立葉紅外光譜儀（FT-IR）分別對(duì)這兩種微膠囊的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。掃描范圍在4000~400 cm?1，記錄樣品的紅外光譜圖。

1.2.10 表面形態(tài)與內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察 采用電子掃描顯微鏡（SEM）觀察柚皮苷/檸檬苦素微膠囊表面形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。先在樣品臺(tái)上貼上一層導(dǎo)電膠，將整個(gè)微膠囊和切成剖面的微膠囊輕輕粘在上面，然后在樣品上噴金，供SEM觀察微膠囊產(chǎn)品表面形態(tài)，加速電壓為20 kV。

1.2.11 微膠囊熱穩(wěn)定性的研究 取5份等量的柚皮苷/檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品和柚皮苷/檸檬苦素微膠囊，分別置于90 ℃下1、2、4、8和12 h，定時(shí)取樣測(cè)定包埋前后柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的保留率，考察溫度等對(duì)柚皮苷/檸檬苦素穩(wěn)定性的影響。

1.2.12 苦味強(qiáng)度測(cè)定 采用ASTREE電子舌儀器的Alphasoft軟件進(jìn)行分析，該系統(tǒng)含有7個(gè)脂膜傳感器，分別是酸味（AHS）、通用（PKS）、咸味（CTS）、鮮味（NMS）、咸味（CTS）、甜味（ANS）和苦味（SCS）傳感器，可以客觀評(píng)價(jià)樣品的苦味等強(qiáng)度值。以柚皮苷/檸檬苦素純品和柚皮苷/檸檬苦素微膠囊為樣品，配制10和20 mg/L的柚皮苷/檸檬苦素（柚皮苷和檸檬苦素之比為5:1）以及相對(duì)應(yīng)的10和20 mg/L的柚皮苷/檸檬苦素微膠囊，取100 mL于電子舌專用測(cè)試燒杯中進(jìn)行測(cè)試。平行測(cè)定4次，從苦味傳感器測(cè)得相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

1.2.13 柚皮苷和檸檬苦素微膠囊在體外累計(jì)釋放率的測(cè)定 人工模擬胃液的配制：取9 mL的濃鹽酸，加約800 mL蒸餾水稀釋，調(diào)pH約為1.2，然后再加胃蛋白酶10 g，混勻后待用；人工模擬腸液的配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.4 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6.8，然后另取胰酶10 g加適量水溶解，最后將兩液混合，定容至1000 mL即得人工腸液，備用。

準(zhǔn)確稱取1 g柚皮苷和檸檬苦素微膠囊2份，分別用人工模擬胃液和模擬腸液定容至20 mL，37 °C水浴，攪拌速度為100 r/min。每隔15 min取1 mL上清液，同時(shí)用等量同溫的胃液和腸液補(bǔ)充，用70%乙醇定容至10 mL，用1.2.1和1.2.2中的方法測(cè)定吸光度A，代入柚皮苷回歸方程y=0.1487x?0.003111和檸檬苦素回歸方程y=4.421x?0.04549得到藥物質(zhì)量濃度C，計(jì)算出累計(jì)釋放百分率，繪制釋放曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析試驗(yàn)

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Prism 8軟件進(jìn)行處理以及用one-way ANOVA（P<0.05）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚皮苦味成分微膠囊工藝的研究

2.1.1 柚皮苷與檸檬苦素比例的確定 柚皮苷和檸檬苦素是柚皮中主要的黃酮和三萜類物質(zhì)，都具有很強(qiáng)的生物活性，但這兩類化合物也是柚皮苦味的主要成分，同時(shí)穩(wěn)定性欠佳，嚴(yán)重影響了其產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，因此將柚皮苷和檸檬苦素進(jìn)行微膠囊化有助于解決這些問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)柚皮苷和檸檬苦素的產(chǎn)品化。前期的研究表明，柚皮苷和檸檬苦素均具有調(diào)節(jié)糖脂代謝的活性，復(fù)合使用效果更佳。柚皮苷在水中溶解性較好，而檸檬苦素微溶于水，因此我們首先需確定柚皮苷與檸檬苦素的比例。從圖1中看出，隨著柚皮苷比例的增加，包埋率也隨之增加，可能因?yàn)殍制ぼ盏母咚苄詫?dǎo)致芯材更好的分散在海藻酸鈉溶液中。在檸檬苦素的質(zhì)量過(guò)低時(shí)，溶液黏稠度下降，芯材無(wú)法被完全包埋，出現(xiàn)了包埋率輕微降低的現(xiàn)象。因此，選擇檸檬苦素與柚皮苷質(zhì)量之比為1:5來(lái)進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

圖 1 不同的檸檬苦素與柚皮苷質(zhì)量之比對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effects of different mass ratios of limonin to naringin on embedding rate of microcapsules

2.1.2 pH對(duì)微膠囊的影響 pH的變化對(duì)殼聚糖和海藻酸鈉所帶電荷、空間構(gòu)象均有一定影響。從圖2中看出，包埋率隨著pH的增加先增加后減少，這是因?yàn)闅ぞ厶堑膒Ka為6.3，海藻酸鈉中古洛糖醛酸的pKa為3.5，甘露糖醛酸的pKa是4.0[20]，在低pH時(shí)，海藻酸鹽中的-COO?基團(tuán)隨著pH的增加而增加，而殼聚糖中的-NH3+也隨之減少，表面帶電的數(shù)量更多，吸附的殼聚糖量也更多，因而成膜反應(yīng)程度也加深，表現(xiàn)為微膠囊膜厚增加。當(dāng)pH=6時(shí)，包埋率達(dá)到峰值，此時(shí)殼聚糖分子幾乎不帶電，電荷密度較低，分子空間伸展也較小，分子擴(kuò)散系數(shù)較高，能更深入地?cái)U(kuò)散到海藻酸鈣凝膠中，發(fā)生的聚電解質(zhì)絡(luò)合的強(qiáng)度高，膜較為致密，對(duì)芯材的擴(kuò)散限制作用也更強(qiáng)，因此包埋率較高[21]。當(dāng)pH=7時(shí)，包埋率降低，這是由于殼聚糖分子遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，其空間結(jié)構(gòu)改變的程度較小，因此與海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)孔徑的匹配程度也變?nèi)酰ど晕⒆儽?。因此，我們選擇pH=6來(lái)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖 2 不同pH對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effects of different pH on embedding rate of naringin/limonin microcapsules

2.1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.3.1 壁芯材比對(duì)微膠囊的影響 壁材和芯材是微膠囊化產(chǎn)品中最主要的物質(zhì)材料，因此壁芯材比是影響其包埋率的一個(gè)重要因素。從圖3中可以看出，包埋率隨著壁芯材比的增加而增加，在壁芯材比2:1時(shí)包埋效果最好。當(dāng)壁芯材比較低時(shí)，制得的微膠囊質(zhì)地柔軟而易變形，芯材容易外露，最終導(dǎo)致破裂，這可能是因?yàn)楹Ｔ逅徕c質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，海藻酸鈉-殼聚糖聚電解質(zhì)膜過(guò)薄，形成的微膠囊機(jī)械強(qiáng)度過(guò)低，導(dǎo)致囊壁不硬實(shí)，故不能進(jìn)行有效的包埋；而當(dāng)壁芯材比較高時(shí)，海藻酸鈉與芯材溶液黏度過(guò)大，針孔堵塞，擠出比較困難，產(chǎn)生嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象[22]，使包埋率降低，藥物利用率也降低。因此選擇壁芯材比4:3、2:1和8:3來(lái)進(jìn)行下一步優(yōu)化。

圖 3 不同壁芯材比對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effects of different wall-to-core ratios on the embedding rate of naringin/limonin microcapsules

2.1.3.2 殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊的影響 殼聚糖是自然界中少見(jiàn)的直鏈陽(yáng)離子聚合物，在微膠囊囊壁的形成過(guò)程中扮演著不可缺少的角色。從圖4中可知，在0.3%~1.2%范圍內(nèi)，隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，微膠囊的成形效果更好，包埋率更高，這是因?yàn)殡S著壁材中殼聚糖含量增加，壁材包覆更加完全，囊壁變硬、不易破裂，因此包埋率隨之上升。在1.2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)包埋率達(dá)到最大值之后，囊壁逐漸增厚，機(jī)械強(qiáng)度也隨之提高，但過(guò)厚的囊壁會(huì)使表面不平滑，出現(xiàn)一定凹陷，導(dǎo)致芯材外露，降低包埋率。因此選用殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%、1.2%和1.5%來(lái)進(jìn)行制備工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖 4 不同殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effects of different mass ratio of chitosan on embedding rate of naringin/limonin microcapsules

2.1.3.3 氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊的影響 氯化鈣在微膠囊的形成過(guò)程中為反應(yīng)提供Ca2+，并且發(fā)揮固化劑的作用。從圖5中可以看出，包埋率隨氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先增大后減小，在3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)處達(dá)到最大值。當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，海藻酸鈉與氯化鈣的結(jié)合不充分，凝膠珠外層的固化膜較薄且結(jié)構(gòu)不夠堅(jiān)硬，使得在制備過(guò)程中隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)而破裂，導(dǎo)致包埋率的降低。氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，外層迅速固化，微膠囊囊壁較厚，但是阻礙了凝膠珠內(nèi)部固化，減少了壁材和芯材的相互接觸，使芯材的附著性能下降，同樣不利于微膠囊包埋率的提高。因此選用氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、3%和4%來(lái)進(jìn)行制備工藝的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖 5 不同氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率的影響Fig.5 Effects of different calcium chloride mass fraction ratio on the embedding rate of naringin/limonin microcapsules

2.1.4 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4.1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)2.1.2和2.1.3實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定柚皮苷與檸檬苦素的比例為5:1和pH=6來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。將壁芯材比（A）、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）作為自變量，對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率（Y）作為響應(yīng)值。共有17個(gè)析因點(diǎn)，其中5個(gè)為中心點(diǎn)，其目的是估計(jì)實(shí)驗(yàn)的純誤差。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表 2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

2.1.4.2 回歸方程的建立與顯著性分析 通過(guò)BBD設(shè)計(jì)Analysis中的ANOVA分析，可得包埋率（Y）與壁芯材比（A）、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）二次多元回歸方程為：

由表3可以看出，該模型顯示為顯著（P<0.05），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05）。R2=0.9587，進(jìn)一步說(shuō)明模型實(shí)際值與方程預(yù)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性。根據(jù)BBD設(shè)計(jì)Optimization中的Numerical得出最優(yōu)試驗(yàn)方案為壁芯材比2.67、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.92%，微膠囊包埋率可達(dá)88.68%。

表 3 回歸方程系數(shù)及顯著性分析Table 3 Regression equation coefficient and significance analysis

2.1.4.3 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊制備工藝驗(yàn)證 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)得到壁芯材比2:1，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%，包埋率達(dá)到最大，使用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合考慮這3個(gè)因素，以柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的包埋率最大值為目標(biāo)值，經(jīng)過(guò)響應(yīng)曲面試驗(yàn)，對(duì)構(gòu)建的二次回歸方程進(jìn)行優(yōu)化后得到當(dāng)壁芯材比8:3、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%和氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%時(shí)，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率約為88.2%，與理論值相對(duì)誤差小于5%。說(shuō)明該工藝準(zhǔn)確可靠，可以用于柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的生產(chǎn)加工。

2.2 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)表征和體外釋放特性

2.2.1 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的FT-IR 分析柚皮苷和檸檬苦素在4000~400 cm?1內(nèi)有明顯的特征峰，柚皮苷的特征峰有：3545、3478、2919、1648、1607、1520、1445、1357、1301、1227、1206、1183、1133、1096、1070 cm?1，檸檬苦素的特征峰有：1756、1710、1602、1505、1387、1370、1352、1285、1263、1210、1187、1122、1020、875、647 cm?1[23]。從圖6可以看出，載柚皮苷和檸檬苦素微膠囊的吸收峰中均出現(xiàn)了柚皮苷和檸檬苦素的特征峰，以上都能有效證明微膠囊中成功載入柚皮苷和檸檬苦素藥物。我們還可以從光譜中看出載藥微膠囊和空微膠囊的基團(tuán)保持一致，充分說(shuō)明了在包埋過(guò)程中未改變?cè)形⒛z囊的分子結(jié)構(gòu)。

2.2.2 微膠囊的結(jié)構(gòu)形態(tài)特征 微膠囊的結(jié)構(gòu)形態(tài)特征影響著微膠囊的性質(zhì)，比如芯材的緩釋速率、微膠囊產(chǎn)品的流動(dòng)特性等。微膠囊表面完整性和內(nèi)部的結(jié)構(gòu)特征影響著芯材的釋放，同時(shí)微膠囊顆粒外部表面形態(tài)與微膠囊產(chǎn)品的流動(dòng)性密切相關(guān)，因此有必要研究微膠囊產(chǎn)品的表面以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。從圖7a和7b中可以看出，微膠囊主要分為三層：最外層為殼聚糖覆膜，沒(méi)有芯材；中間層為混合芯材的海藻酸鈉-殼聚糖聚電解質(zhì)膜；而中心為含有芯材的海藻酸鈣囊芯。這與之前證明海藻酸鈣是以“蛋盒”結(jié)構(gòu)形式存在，藥物鑲嵌在這種“蛋盒”中，從而實(shí)現(xiàn)包埋的結(jié)果相一致[24]。相比于空微膠囊，載柚皮苷和檸檬苦素微膠囊在中間層和中心更為飽滿，分布比較均勻，說(shuō)明柚皮苷和檸檬苦素已被完全包覆。從圖7c中可以看出，微膠囊表面結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)較為均一，表面有皺褶，未見(jiàn)裂縫、孔洞和凹陷現(xiàn)象，表明有較高的微膠囊化效率。其表面的典型皺褶是因銳孔法而存在的，微膠囊干燥后，水分脫去而發(fā)生縮聚，體積與濕微膠囊相比顯著減少，從而導(dǎo)致表面出現(xiàn)皺褶。因此，以上結(jié)果表明，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)可較好地保護(hù)芯材，解決柚皮苷和檸檬苦素的不穩(wěn)定性等問(wèn)題。

圖 6 載柚皮苷和檸檬苦素/空微膠囊的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of naringin and limonin/empty microcapsules

圖 7 掃描電鏡下干微膠囊的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)圖Fig.7 Internal structure and surface morphology of the dry microcapsule under the scanning electron microscope

2.2.3 包埋前后柚皮苷/檸檬苦素微膠囊熱穩(wěn)定性為了驗(yàn)證柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的熱穩(wěn)定性，測(cè)定了包埋前后柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的保留率，由圖8可見(jiàn)，柚皮苷和檸檬苦素具有熱不穩(wěn)定性，樣品加熱12 h后，柚皮苷和檸檬苦素保留率降為28.5%，而將其制成微膠囊產(chǎn)品，則在相同的熱環(huán)境下，其保留率高達(dá)86.7%，這表明柚皮苷/檸檬苦素微膠囊在高溫條件下的穩(wěn)定性明顯高于柚皮苷/檸檬苦素純品，證實(shí)微膠囊化的產(chǎn)品可以改善柚皮苷和檸檬苦素的熱不穩(wěn)定性，與廖霞等[25]研究的海藻酸鈉-殼聚糖制備的微膠囊可提高槲皮素穩(wěn)定性的結(jié)果一致。

圖 8 加熱對(duì)柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的影響Fig.8 Effects of heating on naringin/limonin microcapsules

2.2.4 包埋前后柚皮苷/檸檬苦素的苦味對(duì)比 柚皮苷和檸檬苦素經(jīng)過(guò)微膠囊化，與壁材間存在包埋或者聚合作用，降低了與舌根或軟顎的接觸能力。為了驗(yàn)證微膠囊化降低了柚皮苷和檸檬苦素的苦味，電子舌檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，相比于柚皮苷/檸檬苦素純品，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊在10和20 mg/L的苦味強(qiáng)度都顯著（P<0.05）降低，可見(jiàn)微膠囊化可有效降低柚皮苷和檸檬苦素的苦味。

表 4 含相同濃度的柚皮苷/檸檬苦素溶液和微膠囊溶液苦味的電子舌測(cè)定值Table 4 The relations of sensory value on biterness of Nar/Lim and microcapsule (contain the equal Lim/NAr)

2.2.5 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的體外釋放特性 從圖9（A）中可以看出，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊在模擬胃液中的釋放不呈線性關(guān)系，在0~90 min，微膠囊內(nèi)柚皮苷和檸檬苦素的釋放較為緩慢；90~200 min柚皮苷和檸檬苦素的釋放較快。說(shuō)明在模擬胃液中90 min后，壁材開(kāi)始逐漸溶解，控制速率的障礙輕微減少，因此柚皮苷和檸檬苦素穿過(guò)囊壁向外擴(kuò)散的速率稍微增大。而在圖9（B）中，可以發(fā)現(xiàn)在45 min時(shí)微膠囊在人工模擬腸液中的累計(jì)釋放率已經(jīng)超過(guò)75%?？傮w來(lái)看，微膠囊在人工模擬胃液中釋放非常緩慢，經(jīng)過(guò)6 h后總體釋放率才達(dá)31%左右，而在人工模擬腸液中的釋放迅速。這可能是由于微膠囊囊壁的構(gòu)成與pH有很大的相關(guān)性[26]：在pH約為1.2的模擬胃液中，最外層的殼聚糖與H+結(jié)合成聚陽(yáng)離子，從而開(kāi)始溶解；而囊壁內(nèi)層的海藻酸凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，幾乎不發(fā)生溶脹，阻止了芯材的釋放；在pH較高、偏堿性的模擬腸液中，海藻酸凝膠發(fā)生溶脹，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，堅(jiān)固的海藻酸鈣溶脹破裂，釋放出芯材[27]。此外，黃酮類和三萜類物質(zhì)吸收和代謝的場(chǎng)所主要是在小腸[28?29]，這就意味著柚皮苷和檸檬苦素必須減少在胃中的釋放，增加在腸道中的釋放才能提高其生物利用率，因此具有pH敏感性的海藻酸凝膠微粒在芯材的釋放中發(fā)揮了不可或缺的作用。

圖 9 柚皮苷/檸檬苦素微膠囊在模擬胃液（A）和腸液（B）的釋放速率Fig.9 Release rate of naringin/limonin microcapsules in simulated gastric juice（A）and intestinal juice（B）

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化制備柚皮苷/檸檬苦素微膠囊工藝，確定最優(yōu)工藝參數(shù)為：壁芯材比：2.67、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：0.9%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)：2.92%，此時(shí)包埋率可達(dá)88.68%。對(duì)構(gòu)建的二次回歸方程進(jìn)行優(yōu)化后得到，當(dāng)壁芯材比8:3、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%和氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%時(shí)，柚皮苷/檸檬苦素微膠囊包埋率為88.2%，與理論值相對(duì)誤差小于5%，說(shuō)明該工藝準(zhǔn)確可靠，可以用于柚皮苷/檸檬苦素微膠囊的生產(chǎn)加工。熱穩(wěn)定性和電子舌結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)海藻酸鈉-殼聚糖-氯化鈣微膠囊包埋后，柚皮苷/檸檬苦素苦味強(qiáng)度得到有效降低，且顯著提高了其穩(wěn)定性。SEM結(jié)果可以直觀觀察到柚皮苷/檸檬苦素被完整有效的包裹在微膠囊中，F(xiàn)TIR從分子結(jié)構(gòu)上驗(yàn)證了這一結(jié)果。此外，微膠囊化的柚皮苷/檸檬苦素有效減少其在胃液中的破壞，提高其在腸液中的緩釋能力，促進(jìn)其在腸道內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化與吸收。表現(xiàn)為在模擬胃液中消化6 h后總體釋放率才達(dá)31%左右，在模擬腸液中消化45 min時(shí)累計(jì)釋放率已經(jīng)超過(guò)75%。以上研究結(jié)論為柚皮苷/檸檬苦素的高值化利用以及在相關(guān)食品加工中的穩(wěn)定性與生物利用提供了理論基礎(chǔ)。