侍 方，倪 磊

在人類所有慢性代謝性骨病中，骨質(zhì)疏松癥最為常見，現(xiàn)約有2億患者[1]，其與生理性或病理性雌激素降低密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥在絕經(jīng)后婦女中發(fā)生率顯著升高，稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)[2]。PMOP發(fā)病涉及系統(tǒng)性炎癥激活[3]。粉防己堿(TET)是從粉防己根部提取的活性物質(zhì)，在抗炎、抗腫瘤、促自噬和凋亡方面發(fā)揮作用[4-5]。研究表明，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因存在多個多態(tài)性位點，與PMOP發(fā)生密切相關(guān)[6]。在去勢骨質(zhì)疏松癥小鼠中，TNF-α水平與骨丟失、成骨細胞和骨細胞死亡呈正相關(guān)[7]。此外，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路也參與了PMOP的進程，草烏甲素可降低NF-κB信號通路活性、抑制破骨細胞生成從而達到促進成骨細胞生成的效果[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在去勢骨質(zhì)疏松癥兔模型中，TET通過減少TNF-α的產(chǎn)生抑制NF-κB信號通路激活，降低p65磷酸化水平，進而發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用[9]。但在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生過程中，TET通過何種機制作用于TNF-α及NF-κB信號通路，以及這2個信號通路間的相互關(guān)系尚不清楚。因此，本研究構(gòu)建去勢骨質(zhì)疏松癥兔模型對此問題進行解析,為TET治療骨質(zhì)疏松癥提供更深層次的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 新西蘭兔，雌性，20周齡，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，購自北京實驗動物研究中心。實驗動物許可證號：SYXK(京)2020-0038。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1試劑：TET(美國Sigma公司)，MinuteTM骨組織總蛋白提取試劑盒[中國西寶生物科技(上海)有限公司]，兔TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D公司)，BCA蛋白定量試劑盒(美國ThermoFisher公司)，抗兔β-actin、p85、p-p85、Akt、p-Akt、p65、p-p65、IκBαp-IκBα抗體(美國CST公司)，Anti-Rabbit IgG (美國Abcam公司)，化學(xué)發(fā)光底物(美國ThermoFisher公司)。

1.2.2儀器：Micro-CT小動物活體影像系統(tǒng)(LCT-200，Latheta公司)，酶標(biāo)儀(ELX808，BioTek公司)。

1.3研究方法

1.3.1去勢骨質(zhì)疏松癥兔模型的構(gòu)建：參考文獻[9-10]，采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)法構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥兔模型。模型兔隨機分為造模組、TET組，未切除雙側(cè)卵巢的假手術(shù)組作為對照組，每組6只。TET組每3天腹腔注射TET 40 mg/kg，對照組和造模組處理時換為生理鹽水，持續(xù)4周[9]。處理后各組兔予戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，Micro-CT檢測骨密度(BMD)、相對骨體積(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁間距(Tb.Sp)，以評價兔骨質(zhì)疏松程度。

1.3.2ELISA檢測TNF-α水平：分離各組兔脛骨組織，根據(jù)試劑盒操作說明提取總蛋白，采用兔TNF-α ELISA試劑盒測定TNF-α水平。

1.3.3Western blot法檢測骨組織相關(guān)蛋白表達：嚴(yán)格按照試劑盒提供的操作指南提取各組兔骨組織。采用12.5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，90 V電泳1.5～2.0 h；冰浴條件下100 mA固定電流轉(zhuǎn)膜1 h，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；配制含4.2%脫脂牛奶的TBST緩沖液，封閉PVDF膜；按比例加入抗兔β-actin、p85、p-p85、Akt、p-Akt、p65、p-p65或IκBαp-IκBα抗體，4℃孵育過夜；TBST緩沖液充分洗滌3次，每次15 min；按比例加入Anti-Rabbit IgG二抗，室溫孵育1 h；TBST緩沖液再次充分洗滌后，加入顯影液顯影。實驗重復(fù)3次，最后經(jīng)Image J軟件分析蛋白含量,蛋白相對表達量=目標(biāo)蛋白/β-actin。

2 結(jié)果

2.1TET處理對兔骨質(zhì)疏松癥的保護作用 TET組與造模組相比，兔骨組織BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th升高(P<0.05)，Tb.Sp降低(P<0.01)；造模組與對照組相比，兔骨組織BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均顯著下降(P<0.01)，Tb.Sp顯著升高(P<0.01)。見圖1。

圖1 TET處理對骨質(zhì)疏松癥模型兔關(guān)節(jié)軟骨及骨形成的影響TET為粉防己堿；與造模組比較，aP<0.05,bP<0.01；與對照組比較，cP<0.01

2.2TET處理對兔脛骨組織中TNF-α的影響 對照組脛骨組織中TNF-α含量為(35.8±3.6)pg/ml，造模組為(58.6±5.2)pg/ml，TET組為(45.7±4.9)pg/ml，造模組兔脛骨組織中TNF-α含量顯著高于對照組(P<0.01)，TET組顯著低于造模組(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組骨質(zhì)疏松癥模型兔脛骨組織中TNF-α水平比較TET為粉防己堿,TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，aP<0.01；與造模組比較，bP<0.01

2.3TET處理對PI3K/Akt信號通路活性的抑制作用 與對照組相比,造模組兔骨組織中p-p85和p-Akt表達水平顯著升高(P<0.01)；而TET處理可顯著降低兔骨組織中p-p85和p-Akt表達水平(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組骨質(zhì)疏松癥模型兔骨組織中PI3K/Akt信號通路蛋白表達情況TET為粉防己堿；與對照組比較，aP<0.01；與造模組比較，bP<0.01

2.4TET處理對NF-κB信號通路活性的抑制作用 與對照組相比，造模組兔骨組織中p-IκBα和p-p65相對表達量均顯著升高(P<0.01)；與造模組相比，TET組顯著抑制兔骨組織中p-IκBα和p-p65相對表達量(P<0.01)。見圖4。

圖4 各組骨質(zhì)疏松癥模型兔骨組織中p-IκBα和p-p65蛋白表達情況TET為粉防己堿；與對照組比較，aP<0.01；與造模組比較，bP<0.01

3 討論

在慢性代謝性骨病中，骨質(zhì)疏松癥最為常見，其是因生理性或病理性骨密度降低或骨結(jié)構(gòu)惡化而導(dǎo)致患者骨折風(fēng)險增高的一種疾病[11-13]。相對于男性，女性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率高，絕經(jīng)后女性發(fā)病率尤高，稱為PMOP。PMOP是一種涉及系統(tǒng)性炎癥激活的骨代謝疾病[3]。研究發(fā)現(xiàn)，PMOP與雌激素缺乏密切相關(guān)[14-18]。絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平下降，可引起核因子-κB受體活化因子/核因子-κB受體活化因子配體(RANK/RANKL)信號通路和炎癥相關(guān)信號通路激活，TNF家族細胞因子合成和釋放增加[19]。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可誘導(dǎo)SOX5上調(diào)，并調(diào)控KLF4信號通路，從而抑制人骨髓間充質(zhì)細胞的成骨分化。在去勢骨質(zhì)疏松癥兔模型中，通過抑制TNF-α能夠有效緩解病情[9]。此外，與健康絕經(jīng)女性相比,PMOP患者血清TNF-α水平升高，而且TNF-α水平與RANK和雌激素水平相關(guān)[21]。以上研究結(jié)果表明，TNF-α介導(dǎo)了PMOP的發(fā)生。

有研究還發(fā)現(xiàn)，在去勢骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中，四物湯可影響其PI3K/Akt和NF-κB信號通路活性，從而刺激骨形成[22]。Zha等[21]發(fā)現(xiàn)TNF-α可激活RAW264.7細胞系中PI3K/Akt信號通路，協(xié)同提高NF-κB信號通路活性，增加IκBα和p65磷酸化水平；TNF-α可增強RANKL誘導(dǎo)的NF-κB信號通路激活，促進破骨細胞增殖。因此推測PMOP患者血清中高水平的TNF-α可激活PI3K/Akt信號通路，從而促進破骨細胞增殖導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。本研究發(fā)現(xiàn)，在去勢骨質(zhì)疏松癥兔模型中，BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th顯著降低，而Tb.Sp則顯著升高；造模組兔脛骨組織中TNF-α含量高于對照組，同時伴隨PI3K/Akt信號通路的激活，IκBα和p65磷酸化水平也顯著升高。結(jié)果表明，在去勢骨質(zhì)疏松癥兔模型中，骨組織中TNF-α含量增加可激活PI3K/Akt/NF-κB信號通路，促進破骨細胞增殖而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。

TET是從粉防己根中提取獲得的天然活性物質(zhì)[23]，除具有抗腫瘤、促凋亡和抗氧化等作用外，還具有顯著的抗炎活性[24-27]。最新研究表明，TET可在體外抑制TNF-α的產(chǎn)生，抑制p65磷酸化水平，抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞增殖效應(yīng)[9]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，TET處理后可顯著升高去勢骨質(zhì)疏松癥兔模型脛骨組織中BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th，降低Tb.Sp、TNF-α含量，抑制p85、Akt、IκBα和p65磷酸化，抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路活性，繼而減輕骨質(zhì)疏松癥癥狀。本研究證實了TNF-α通過激活PI3K/Akt信號通路促進下游NF-κB信號通路活性,是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要分子機制;TET可靶向抑制TNF-α的產(chǎn)生，發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用。

綜上,TET可抑制TNF-α介導(dǎo)的PI3K/Akt/NF-κB信號通路激活,減輕病情，是治療PMOP的有效藥物,為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。