白云飛，崔曉波，王博謙，王亞平，楊莉娜，劉佳榮，覃 潔

喉癌起源于喉黏膜上皮，是頭頸部主要惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的1%～5%[1]，且病死率高[2]。目前，喉癌治療方法以外科手術(shù)、放療、化療或聯(lián)合治療為主，但通常會發(fā)生較嚴重的不良反應(yīng)，嚴重影響新患者的治療和預(yù)后[3]。因此，迫切需要研發(fā)新的有效治療藥物。固本抑瘤Ⅱ號(GYⅡ)是由多名著名中醫(yī)在經(jīng)方基礎(chǔ)上結(jié)合臨床實踐經(jīng)驗研制的具有益氣、活血、解毒作用的綜合方劑。多項臨床試驗已證實，GYⅡ具有良好的抗腫瘤作用，可有效緩解化療的毒副作用，減輕化療引起的氣虛血瘀證狀[4-5]。但目前尚無GYⅡ在喉癌中應(yīng)用的報道。近年來ERK和Akt信號通路已被確定為腫瘤治療的潛在靶點，最新研究表明，在小鼠乳腺癌模型中，GYⅡ可通過抑制ERK和Akt信號通路激活，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[6-7]。因此，本研究構(gòu)建Hep-2荷瘤小鼠，探究GYⅡ的抗腫瘤作用，以及其是否通過作用于ERK和Akt信號通路而發(fā)揮生物學(xué)功能的。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6周齡雌性裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。在22℃、濕度55%、12 h/12 h明暗光照循環(huán)條件下飼養(yǎng)。

1.2主要試劑

1.2.1GYⅡ制備方法：GYⅡ由北京中醫(yī)院提供，由黨參、茯苓、蒼術(shù)、黃芪、川芎、白術(shù)等13味中藥組成，按照《中國藥典(2010)》規(guī)程和《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》生產(chǎn)，經(jīng)石油醚脫脂，水提醇沉和去蛋白程序獲得。臨用前，用0.9%氯化鈉注射液溶解至0.05和0.10 mg/ml[8]。

1.2.2檢測試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)和雙抗購自Gibco公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司；蛋白免疫印跡使用的一抗anti-β-actin(1︰1000)購自Santa Cruz公司，anti-ERK1/2(1︰500)、anti-ERK1/2(1︰1000)、Akt(1︰1000)和p-Akt(1︰500)均購自CST公司；小鼠腫瘤組織解離液購自美天旎生物技術(shù)公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒及4%多聚甲醛固定液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.3實驗儀器：流式細胞儀(FACS Calibur，BD公司)，輪轉(zhuǎn)式切片機(HistoCore MULTICUT，徠卡公司)，CO2培養(yǎng)箱(4111，Thermo公司)，數(shù)顯游標(biāo)卡尺(0～150 mm，Mitutoyo公司)，全自動組織處理器(gentleMACS，美天旎生物技術(shù)公司)，顯微鏡(BX51，奧林巴斯株式會社)。

1.3研究方法

1.3.1Hep-2細胞培養(yǎng)：Hep-2細胞系從中國典型培養(yǎng)物保藏中心購買，并于本實驗室傳代、保存。用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2，當(dāng)細胞匯集率達90%時傳代。

1.3.2Hep-2荷瘤小鼠模型的構(gòu)建：將對數(shù)生長期Hep-2細胞制成無血清細胞懸液，接種于裸鼠背部，每只接種100 μl，含有2×106細胞，待瘤體直徑約50 mm3時，采用隨機數(shù)字表法將模型小鼠分為模型組、GYⅡ 2.5 g/kg組和GYⅡ 5.0 g/kg組，每組5只，GYⅡ不同劑量組灌胃法給藥，每日1次，持續(xù)30 d，模型組替換為生理鹽水。每3天測量腫瘤體積1次。腫瘤體積=1/2×a(長徑)×b(短徑)2[7]。

1.3.3腫瘤單細胞懸液制備：實驗終點，剪開小鼠背部皮膚，鈍性分離取出腫瘤，將腫瘤置于預(yù)冷的RPMI 1640培養(yǎng)液中。配制小鼠腫瘤解離液，按照Gentle MACS腫瘤解離器使用說明解離腫瘤，經(jīng)70 μm細胞篩過濾獲得單細胞懸液。

1.3.4Annexin-V和PI流式細胞凋亡檢測：上述獲得的細胞懸液用PBS液洗滌2次，收集細胞加入200 μl Binding Buffer、10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI后混合，避光條件下孵育30 min，緩慢加入PBS液400 μl，防止劇烈操作導(dǎo)致細胞破裂，隨后立即用流式細胞儀進行檢測。

1.3.5TUNEL凋亡染色：使用TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測腫瘤組織中凋亡細胞數(shù)量，腫瘤組織經(jīng)冰凍切片，切片厚10 μm，浸入4%多聚甲醛15 min后，PBS液充分清洗3次，每次15 min。后行TUNEL染色，主要步驟：按照使用說明配制TUNEL反應(yīng)液；取反應(yīng)液50 μl加至預(yù)處理好的切片組織正中，室溫靜置孵育1 h；DAB染色，置于光鏡下，隨時觀察以控制染色時間；蘇木精復(fù)染，時間2～3 min，染色完成后蒸餾水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明組織，封片。凋亡細胞計數(shù)方法：置于OLYMPUS普通光學(xué)顯微鏡下，隨機選取5個視野，通過劃“正”字法計數(shù)TUNEL陽性細胞，5個視野細胞數(shù)量求和作為總數(shù)，最終統(tǒng)計數(shù)量以總數(shù)/5±標(biāo)準差表示。

1.3.6Western blot法測定ERK和Akt蛋白磷酸化表達：研缽預(yù)冷狀態(tài)下加入瘤組織，快速研磨成粉末狀后立即加入同等適量RIPA裂解液，充分混勻提取總蛋白并采用BCA法定量，將等量蛋白提取液(蛋白量約45 μg)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；40 V電壓下轉(zhuǎn)膜1 h至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；將PVDF在4.5%脫脂牛奶緩沖液中室溫封閉1 h；清洗后按比例加入相應(yīng)一抗，4℃靜置過夜；TBST緩沖液清洗3次，每次15 min；加入對應(yīng)二抗，注意二抗需與顯色方式相對應(yīng)，然后室溫孵育1 h；顯影并拍攝，Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1腫瘤生長情況 模型組小鼠瘤體持續(xù)生長，至處理第30天，瘤體達(1387±232)mm3；GYⅡ灌胃給藥第12天，腫瘤體積逐漸小于模型組，至第30天，GYⅡ 2.5 g/kg組腫瘤體積為(765±152)mm3，GYⅡ 5.0 g/kg組腫瘤體積為(440±98)mm3。見圖1。至實驗終點，GYⅡ 2.5 g/kg組和GYⅡ 5.0 g/kg組腫瘤體積均小于模型組，GYⅡ 5.0 g/kg組腫瘤體積小于GYⅡ 2.5 g/kg組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖1 Hep-2荷瘤小鼠腫瘤生長曲線GYⅡ為固本抑瘤Ⅱ號

圖2 實驗終點各組Hep-2荷瘤小鼠腫瘤體積比較GYⅡ為固本抑瘤Ⅱ號；與模型組比較，aP<0.01；與GYⅡ 2.5 g/kg組比較，bP<0.01

2.2腫瘤細胞凋亡情況 模型組腫瘤細胞凋亡率為(6.2±1.2)%，GYⅡ 2.5 g/kg組腫瘤細胞凋亡率為(15.8±4.3)%，GYⅡ 5.0 g/kg組腫瘤細胞凋亡率為(36.5±5.2)%。GYⅡ 2.5 g/kg組和GYⅡ 5.0 g/kg組腫瘤細胞凋亡率均高于模型組，GYⅡ 5.0 g/kg組高于GYⅡ 2.5 g/kg組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3、4。TUNEL凋亡染色結(jié)果所示，模型組TUNEL陽性細胞數(shù)量為(23±4)個，GYⅡ 2.5 g/kg組為(68±15)個，GYⅡ 5.0 g/kg組為(147±36)個。GYⅡ 2.5 g/kg組和GYⅡ 5.0 g/kg組腫瘤凋亡細胞數(shù)量均高于模型組，GYⅡ 5.0 g/kg組高于GYⅡ 2.5 g/kg組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5、圖6。

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組Hep-2荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡率GYⅡ為固本抑瘤Ⅱ號

圖4 各組Hep-2荷瘤小鼠細胞凋亡率比較GYⅡ為固本抑瘤Ⅱ號；與模型組比較，aP<0.01；與GYⅡ 2.5 g/kg組比較，bP<0.01

圖5 各組Hep-2荷瘤小鼠TUNEL凋亡染色圖片(100×)GYⅡ為固本抑瘤Ⅱ號

圖6 各組Hep-2荷瘤小鼠TUNEL陽性細胞數(shù)量比較GYⅡ為固本抑瘤Ⅱ號；與模型組比較，aP<0.01；與GYⅡ 2.5 g/kg組比較，bP<0.01

2.3GYⅡ?qū)RK和Akt信號通路的影響 GYⅡ 2.5 g/kg組和GYⅡ 5.0 g/kg組腫瘤組織中p-ERK和p-Akt蛋白表達量較模型組低，且GYⅡ 5.0 g/kg組低于GYⅡ 2.5 g/kg組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖7、圖8。

圖7 各組Hep-2荷瘤小鼠ERK和Akt相關(guān)蛋白表達情況GYⅡ為固本抑瘤Ⅱ號

圖8 各組Hep-2荷瘤小鼠p-ERK和p-Akt蛋白表達量GYⅡ為固本抑瘤Ⅱ號；與模型組比較，aP<0.01；與GYⅡ 2.5 g/kg組比較，bP<0.01

3 討論

喉癌是頭頸部第二常見惡性腫瘤[2]，傳統(tǒng)治療方法均可導(dǎo)致不同程度的不良反應(yīng)，如免疫抑制、營養(yǎng)代謝紊亂等[9-14]。因此，研發(fā)新的有效的喉癌治療藥物勢在必行。中藥已有數(shù)千年的實踐歷史，目前已被廣泛應(yīng)用于肝癌、乳腺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌等多種癌癥的治療[15-16]，具有抗藥性低、毒副作用小等優(yōu)點[17-22]。GYⅡ是根據(jù)益氣、活血化瘀、解毒散結(jié)理論研制的由13種不同中草藥組成的綜合方劑[7]，可與化療和放療協(xié)同作用提高癌癥的治療效果，延長患者生存期，改善患者預(yù)后[4]。在Lewis肺癌移植瘤小鼠中，GYⅡ可誘導(dǎo)細胞凋亡從而抑制腫瘤生長[23]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠乳腺癌模型中，GYⅡ可抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，作用機制與抑制ERK和Akt信號通路有關(guān)[7]。但目前關(guān)于GYⅡ在喉癌中治療效果的報告較少。本研究證實，在Hep-2荷瘤模型鼠中，不同劑量GYⅡ處理均能夠抑制腫瘤細胞生長，腫瘤體積顯著小于模型組，且能加速腫瘤細胞凋亡。

Akt和ERK信號通路在癌癥患者體內(nèi)異常激活，既往一直是癌癥治療的靶點。Akt信號通路參與腫瘤細胞生長、增殖、存活、遷移和侵襲的調(diào)節(jié)；ERK信號通路是重要的促有絲分裂信號通路[6,24]。Akt和ERK信號通路能夠抑制腫瘤細胞凋亡，相反通過基因敲除技術(shù)或靶向藥物抑制Akt和ERK信號通路活性則可抑制腫瘤進展。在下咽部鱗狀細胞癌患者中，GDC-0980處理能夠明顯降低FaDu細胞中Akt和ERK磷酸化水平，將癌細胞阻滯于G1期，抑制腫瘤細胞增殖[25]。TBX1因子失活可降低甲狀腺癌細胞PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路活性，延緩疾病進展[26]。但目前關(guān)于GYⅡ?qū)戆┘毎鸄kt和ERK信號通路影響的研究較少。本研究結(jié)果顯示，在Hep-2荷瘤小鼠中，GYⅡ可顯著降低ERK和Akt蛋白磷酸化水平，抑制ERK和Akt信號通路活性，加速腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，且與GYⅡ劑量呈正相關(guān)。但是，腫瘤進展涉及到多種信號通路，并且ERK和Akt信號通路除了具有抗凋亡、促增殖作用外，還具有調(diào)節(jié)血管生成等作用，因此GYⅡ?qū)戆┑囊种谱饔眠€有待更深入的研究[27-28]。

綜上，在Hep-2異種移植模型小鼠中，GYⅡ通過抑制ERK和Akt信號通路活性，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，GYⅡ有望成為喉癌患者有效的輔助治療方劑。本研究進一步拓展了GYⅡ治療的腫瘤類型，為其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。