趙學正　　高偉　　唐保永　　鄭思化　　李利軍

[關(guān)鍵詞] 5-羥基-4'-硝基-7-丙酰氧基金雀異黃素;增殖;遷移;侵襲;凋亡

[中圖分類號] R738.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）16-0037-06

Effects and mechanisms of novel genistein derivatives in inhibiting the migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells

ZHAO Xuezheng? ?GAO Wei? ?TANG Baoyong? ?ZHENG Sihua? ?LI Lijun

Department of Orthopedics， Hangzhou Xixi Hospital， Hangzhou? ?310023， China

[Abstract] Objective To detect the inhibitory effect of novel genistein derivatives HNPG on the migration and invasion of osteosarcoma MG-63 cells and its possible molecular biological mechanism. Methods Osteosarcoma MG-63 cells were cultured in vitro，and MTT was used to detect the proliferation inhibitory effect of HNPG on MG-63 cells. The scratch test was used to detect the migration inhibitory effect of HNPG on MG-63 cells. The Transwell was used to detect the inhibitory effect of the invasion of HNPG on MG-63 cells. PI staining FCM was used to detect the blocking effect of HNPG on the G1 phase of MG-63 cells. AV-PI staining FCM was used to detect the apoptosis induction effect of HNPG on MG-63 cells. Western blotting was used to detect the regulatory effect of HNPG on the expression of p53，bcl-2， and bax proteins in MG-63 cells. Results HNPG inhibited the proliferation of MG-63 cells in a time and concentration-dependent manner in vitro. The IC50 of 24 h was（4.8±0.6） μmol/L. The 24 h proliferation inhibition rate of MG-63 cells treated by 5 μmol/L of HNPG was（45.2±4.6）%， which was higher than that of（0.40±0.02）% in the NS group， the difference was significant （P<0.05）. The scratch healing rate was（38.24±2.48）%， which was lower than that of （71.23±4.62）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. The invasion inhibition rate was（44.66±2.06）%，which was higher than that of （0.34±0.03）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. The proportion of cells in the G1 phase （78.65±3.48）%， which was higher than that of （64.40±2.02）% in the NS group，the difference was significant （P<0.05）. The apoptosis rate was increased more statistically（24.63±2.12）%， which was higher than that of （2.75±0.20）% in the NS group， the difference was significant（P<0.05）. At the same time the expression of p53 and bax protein was up-regulated， while the expression of bcl-2 protein was down-regulated，which was statistically significant compared with the NS group（P<0.05）. Conclusion HNPG can significantly inhibit the proliferation， migration， and invasion of MG-63 cells in vitro，and its mechanism may be that it blocks cells in G1 phase， up-regulates the expression of p53 protein， activates the expression of bax protein， inhibits the expression of bcl-2 protein， and induces apoptosis.

[Key words] 5-hydroxy-4'-nitro-7-propionyloxygenistein; Proliferation; Migration; Invasion; Apoptosis

化療在骨肉瘤治療方面有著極其重要的作用，術(shù)后化療和新輔助化療的臨床應用極大改善了骨肉瘤患者預后，因此開發(fā)新型化療藥物便成為腫瘤工作者的靶向之一[1]。既往文獻報道，金雀異黃素具有抗腫瘤等作用，然而溶解度差、生物利用度小限制了其臨床應用[2]，而通過基因修飾可以提高GEN的溶解性和生物利用度，增加抗腫瘤活性，新型金雀異黃素衍生物（5-hydroxy-4'-nitro-7-propionyloxy-genistein，HNPG）是在金雀異黃素母核C-4'引進硝基、C-7引進丙酰氧基的新型衍生物，具有抗腫瘤活性[3]，然而其對骨腫瘤的生物作用尚未進行報道。本研究通過檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞活性的抑制作用，探討其可能的細胞通路，為HNPG的抗腫瘤應用提供理論指導和實驗數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 骨肉瘤MG-63細胞體外培養(yǎng)和實驗耗材

人骨肉瘤MG-63細胞購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，對數(shù)生長期的MG-63細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)箱溫度為37℃，濕度為飽和濕度內(nèi)含5%CO2。HNPG（分子式：C18H13O7N，分子量：355，色澤：淺黃色，性狀：粉末，純度：98%）由海軍軍醫(yī)大學金永生教授惠贈。一抗p53（BM4206）、bcl-2（A00040-1）、bax（A00183）和GAPDH（A00227-1）購自BOSTER生物技術(shù)有限公司。MTT（C0009）、青霉素-鏈霉素溶液（100×）（C0022）、胰蛋白消化酶（C0205）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0012S）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（C0162）購自Beyotime生物技術(shù)研究所。細胞裂解液（ARAR0107）和標準胎牛血清（PYG0001）購自BOSTER生物技術(shù)有限公司。

1.2 MTT法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制率

取96孔細胞培養(yǎng)板，以密度5000個/孔接種MG-63細胞，培養(yǎng)24 h待其貼壁，然后每孔添加HNPG使其終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L，待HNPG作用細胞24 h后，采用酶標儀檢測HNPG對MG-63細胞的增殖抑制率，獲取HNPG抑制MG-63細胞增殖的最佳濃度用于后續(xù)實驗。取DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（5、10、20 μmol/L）培養(yǎng)24 h，棄去細胞培養(yǎng)基，更換新的細胞培養(yǎng)基，添加 MTT使其終濃度為5 mg/L，作用MG-63細胞4 h，棄去含MTT的細胞培養(yǎng)基，每孔添加100 μL DMSO，靜置10 min，上酶標儀（型號：ELX-800 type）檢測MG-63細胞結(jié)晶紫光密度，發(fā)射光波長為570 nm。細胞增殖抑制率公式：IR=（1-λ實驗組/λ空白對照組）×100%，按改良寇氏法求出IC50[4]。以上實驗重復3次。

1.3劃痕實驗檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞遷移的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，培養(yǎng)24 h后完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，用200 μL無菌槍頭在孔內(nèi)輕輕地劃1～3道痕，再用PBS沖洗去掉脫落的細胞，倒置顯微鏡下拍照。隨后添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，95%酒精固定，隨意選取3個不同位置，在倒置顯微鏡下拍照（×100），并采用Image J軟件測量劃痕寬度，計算平均值，以劃痕愈合率代表細胞的遷移能力，劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%[5]。實驗重復3次，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.4 Transwell法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞侵襲的影響

取預冷24 h的24孔Transwell培養(yǎng)板，將30 μL MatrigelTM人工基質(zhì)膠（無血清培養(yǎng)基按1：3配置），輕柔地鋪在Transwell裝置的上室并靜置3 h。取對數(shù)期生長的MG-63細胞200 μL（2×105/mL）置于上室的膠層上，再將上室置于每孔含DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）10%胎牛血清+RPMI 1640培養(yǎng)液500 μL的下室中，于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h，然后用PBS液沖洗膠層，在室溫下用95%甲醇固定15 min，再用結(jié)晶紫染色15 min。高倍鏡（200×）下隨機對5個視野的細胞進行連續(xù)計數(shù)，取均值。侵襲抑制率按如下公式計算：細胞侵襲抑制率（%）=（空白對照組穿膜細胞數(shù)-實驗組穿膜細胞數(shù)）/空白對照組穿膜細胞數(shù)×100%[6]。實驗重復3次，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.5 FCM法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞周期的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，培養(yǎng)24 h完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，分別添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換細胞培養(yǎng)基，用0.25%的胰酶消化，以2000 rpm離心5 min，棄去上清液，分別用50 mmol/mL的碘化吡啶（PI）溶液1 mL混懸，在暗室于37℃靜置30 min，用DMEM細胞培養(yǎng)液混懸3次，采用流式細胞儀進行檢測，實驗用激發(fā)波為488 nm，而實驗用發(fā)射波為530 nm[7]。細胞周期檢測重復3次，取細胞周期的平均值進行統(tǒng)計分析。

1.6 FCM法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞凋亡的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，培養(yǎng)24 h完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，分別添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）和HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕微震蕩洗2遍，然后采用0.25%的胰酶消化MG-63細胞，將消化收集的細胞以2000 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液，分別用50 mmol/mL的膜聯(lián)蛋白V（Annexin-V）和碘化吡啶（PI）溶液1 mL混懸，在暗室于37℃靜置30 min，用DMEM細胞培養(yǎng)液混懸3次，采用流式細胞儀進行檢測，實驗用激發(fā)波為488 nm，而實驗用發(fā)射波530 nm[8]。實驗重復3次，取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.7 Western blotting法檢測HNPG對骨肉瘤MG-63細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，培養(yǎng)24 h完全貼壁后，更換培養(yǎng)基，添加不同濃度的HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用冰PBS輕微震蕩洗MG-63細胞3次，用無菌濾紙條洗干凈殘余PBS液體后，加入PMSF裂解細胞并提取蛋白，取30 μg MG-63細胞蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，再用5%脫脂牛奶-TBST室溫搖床封閉PVDF膜2 h，在37℃條件下用一抗孵育PVDF膜3 h，二抗孵育PVDF膜1 h，ECL激發(fā)PVDF膜上熒光，X線片壓片，經(jīng)顯影定影后，用Imange J 2200軟件分析處理[9]。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制的影響

取不同濃度的HNPG（0.625、1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L）分別作用于骨肉瘤MG-63細胞24 h，發(fā)現(xiàn)HNPG對細胞的增殖抑制率隨濃度增加而增加，其中HNPG濃度在1.25～20.00 μmol/L范圍之間抑制作用顯著，不同濃度的HNPG對骨肉瘤MG-63細胞的增殖抑制率與NS組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1A。選取2.5、5.0、10.0 μmol/L的HNPG為研究對象，發(fā)現(xiàn)HNPG對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制呈時間依賴性，其中5.0、10.0 μmol/L HNPG在12、24、48 h時間段對MG-63細胞的抑制率分別為（21.6±3.2）%、（45.2±4.6）%、（50.4±5.2）%，較NS組的（0.40±0.02）%顯著升高，不同組的HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）在12、24、48 h時間段對MG-63細胞的抑制率組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），HNPG作用MG-63細胞24 h的IC50為（4.8±0.6）μmol/L;其中5 μmol/L的 HNPG 對骨肉瘤MG-63細胞增殖抑制作用與5 μmol/L DDP（43.8±4.8）%或160 μmol/L GEN（44.2±5.0）%相當，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1B。

2.2 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞遷移的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，分別經(jīng)DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，劃痕愈合率分別為（39.27±3.24）%、（37.84±3.08）%、（52.91±2.64）%、（38.24±2.48）%和（7.26±0.39）%，較NS組的（71.23±4.62）%顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。HNPG各組之間，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG組與160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP組細胞劃痕愈合率相當，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1、圖2。

2.3 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞侵襲的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，分別經(jīng)DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細胞侵襲率分別為（42.72±2.93）%、（48.54±3.17）%、（23.30±1.38）%、（44.66±2.06）%和（87.39±4.05）%，較NS組的（0.34±0.03）%顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。HNPG各濃度組之間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG組與160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP組細胞侵襲率相當，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見封三圖6。

2.4 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞周期的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，分別添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，F(xiàn)MC檢測發(fā)現(xiàn)MG-63細胞G1期比率增高，細胞G1期分別為（79.05±3.24）%、（77.77±4.08）%、（69.23±2.64）%、（78.65±3.48）%和（87.26±4.79）%，較NS組的（64.40±2.02）%顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。HNPG各組之間，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG組與160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP組細胞G1期相當，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖3。

2.5 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞凋亡的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，分別添加DDP（5 μmol/L）、GEN（160 μmol/L）、HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MG-63細胞凋亡率分別為（22.74±1.52）%、（22.08±1.71）%、（10.41±1.17）%、（24.63± 2.12）%和（34.40±3.16）%，較NS組的（2.75±0.20）%顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。HNPG各濃度組凋亡率之間兩兩進行比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;其中5 μmol/L的HNPG組與160 μmol/L的GEN或5 μmol/L DDP組細胞凋亡率相當，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖4。

2.6 HNPG對骨肉瘤MG-63細胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的影響

取對數(shù)期生長的MG-63細胞，分別添加不同濃度HNPG（2.5、5.0、10.0 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取MG-63細胞蛋白并檢測其平均相對灰度值，結(jié)果顯示HNPG各濃度組蛋白表達平均相對灰度值與NS組比較，p53和bax蛋白表達隨濃度增大而增大，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與NS組比較，MG-63細胞bcl-2蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖5。

3 討論

腫瘤細胞的異常增殖、遷移和侵襲是惡性腫瘤的重要表征，腫瘤細胞的異常增殖，致使瘤體組織壓迫、浸潤和侵襲周圍組織的范圍和強度增大，遠處轉(zhuǎn)移機會增多，釋放入體內(nèi)的有害物質(zhì)增多;腫瘤細胞發(fā)生遷移，轉(zhuǎn)移到其他部位，繼續(xù)破壞器官組織;同時腫瘤細胞會發(fā)生局部浸潤、侵襲，破壞組織結(jié)構(gòu)，嚴重威脅患者的身心健康，因此抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，是腫瘤治療的首要舉措和衡量指標[10-11]。化療是骨腫瘤的重要治療舉措之一，化學藥物不僅可以抑制腫瘤細胞增殖，還可以殺死腫瘤細胞，使患者的無瘤生存期延長，極大改善了患者生活質(zhì)量[10]。在臨床化療藥物的基礎(chǔ)上，通過改變藥物化學結(jié)構(gòu)，提高藥物的生物吸收度和生物學性狀，增加藥物對腫瘤細胞增殖抑制率是當前的研究熱點[11]。本研究將不同濃度的HNPG作用于對數(shù)期生長的骨肉瘤MG-63細胞，結(jié)果顯示HNPG在體外對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲有顯著的抑制作用，與其先導化合物GEN及DDP抗腫瘤效果相似[2-3]，提示HNPG作為一種抗腫瘤物質(zhì)，極具研究價值。

細胞增殖必須依次經(jīng)過G1、S、G2、M期，同時細胞在增殖過程任何一期進程減慢、停滯、加速均可能引起疾病的發(fā)生[12]。細胞周期的進展，受周期素、周期依賴性激酶、周期依賴性激酶抑制因子、細胞周期檢測點等因素的調(diào)控[13]。細胞周期檢測點包括DNA損傷檢查點、DNA復制檢查點、染色體分離檢查點和紡錘體組裝檢查點，各檢查點所處的位置和功能各異，其中DNA損傷檢查點備受關(guān)注;當位于G1/S交界的DNA損傷檢查點探測和獲得DNA受損的信號后，則由效應器中斷細胞周期進程，將細胞阻滯于G1期，并啟動DNA修復，以保證DNA的質(zhì)量[14]。凋亡是細胞在誘導凋亡的相關(guān)因素作用下，啟動信號轉(zhuǎn)導，凋亡基因接受死亡信號后按預定程序啟動合成執(zhí)行凋亡所需的多種酶而引發(fā)的一種程序性死亡，凋亡在疾病發(fā)生發(fā)展中具有積極的意義[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的HNPG作用下MG-63細胞增殖、遷移和侵襲受到抑制，伴隨細胞周期G1期比例和細胞凋亡率顯著增高，提示HNPG對MG-63細胞增殖、遷移和侵襲的抑制，可能與其引起細胞周期G1期阻滯，進而誘導凋亡密切相關(guān)，與Song等[16]報道的GEN抑制MG-63細胞增殖和誘導凋亡的效果及其分子生物學機制相似，但HNPG的生物活性顯著高于GEN。

p53蛋白具有誘導細胞凋亡和抑制增殖的作用，其主要在G1/S期交界處發(fā)揮檢查點的功能，當其發(fā)現(xiàn)線粒體DNA損傷時，通過刺激周期依賴性激酶抑制因子表達引起G1期阻滯，并啟動DNA修復，如修復失敗直接激活bax凋亡基因或下調(diào)bcl-2抗凋亡基因表達，啟動細胞凋亡程序，將可能演變?yōu)榘┘毎麥缭诿妊繝顟B(tài)[17-18]。bcl-2和bax蛋白存在于線粒體的雙層磷脂酶上，二者共同作用調(diào)控線粒體膜內(nèi)外物質(zhì)轉(zhuǎn)運，當bcl-2和bax蛋白表達比例失調(diào)，導致線粒體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運異常，進而引起細胞功能障礙[19-20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的HNPG作用于MG-63細胞后，細胞周期阻滯于G1期，細胞凋亡率顯著增高，細胞G1期阻滯和凋亡誘導可能與HNPG上調(diào)p53、bax蛋白表達，下調(diào)bcl-2蛋白表達相關(guān)，與Song等[16]報道的GEN抑制MG-63細胞增殖和誘導凋亡的效果與分子生物學機制相似，但HNPG的生物活性顯著高于GEN。

綜上所述，HNPG在體外可顯著抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和侵襲，其分子生物學機制可能是引起細胞DNA損傷，激活細胞內(nèi)p53蛋白表達，阻滯細胞于G1期，進而上調(diào)bax蛋白，下調(diào)bcl-2蛋白表達，啟動細胞內(nèi)預存程序性死亡基因，誘導細胞凋亡所致。然而HNPG在體內(nèi)是否抑制腫瘤細胞生長增殖，以及HNPG與其他傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物是否有協(xié)同作用，需要進一步深入研究。

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（收稿日期：2020-12-05）