薛亞茹 李瑩 李映志

摘要蔗糖合成酶（ sucrose synthase，? SS）作為催化蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一，能夠參與蔗糖的代謝和運(yùn)輸，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與細(xì)胞壁的形成，對(duì)調(diào)控作物的品質(zhì)和產(chǎn)量也有重要作用?？寺〕霾ぬ}蜜 AhSS2基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。菠蘿蜜 AhSS2基因的開放閱讀框（ open reading frame，? ORF）全長(zhǎng)2436 bp，共編碼811個(gè)氨基酸，其蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)顯示，相對(duì)分子量是92.583 ku，等電點(diǎn)pI為5.77，屬親水性酸性蛋白質(zhì)，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為 Alpha helix （α-螺旋）。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，菠蘿蜜 AhSS2基因?qū)儆?PLN00142超級(jí)家族成員，主要包括蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域（ Sucrose_synth）與糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（Glycos_transf_1）2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，菠蘿蜜 AhSS2基因蛋白的磷酸化位點(diǎn)主要是絲氨酸（ Ser）磷酸化位點(diǎn)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，菠蘿蜜 AhSS2基因在分類上屬 SSⅡ。本研究為進(jìn)一步研究菠蘿蜜蔗糖合成酶家族成員的功能提供依據(jù)。關(guān)鍵詞菠蘿蜜;蔗糖合成酶;生物信息學(xué);系統(tǒng)進(jìn)化分析

中圖分類號(hào) S667.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.015

Bioinformatics Prediction and Comparative Analysis of Jackfruit AhSS2 Gene

XUE Yaru? LI Ying? LI Yingzhi

（Coastal Agricultural College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524000， China）

Abstract? Sucrose? synthase （SS） is? one? of? the? key? enzymes? catalyzing? sucrose? metabolism. It? can participate in sucrose metabolism and transportation， regulate cell differentiation and cell wall formation， and also play an important role in regulating crop quality and yield. Jackfruit AhSS2 gene was cloned and bioinformatic analysis was performed. The open reading frame （ORF） of jackfruit AhSS2 gene is full-length 2436 bp， encoding a total of 811 amino acids. The predicted relative molecular weight of the protein is 92.583ku， and the isoelectric point （Pi） is 5.77. It is a hydrophilic acidic protein and its secondary structure is mainly? alpha helix （α-Spiral）. The? conserved? domain? analysis? showed that the jackfruit AhSS2 gene belonged to a PLN00142 superfamily member， including two conserved domains： sucrose synthase domain （Sucrose_synth） and? glycosyltransferase? domain （glycos_ transf_1）. Prediction? of phosphorylation? sites showed that the phosphorylation sites of the jackfruit AhSS2 gene are mainly serine （Ser） phosphorylation sites. Phylogenetic tree analysis showed that the jackfruit AhSS2 gene belonged to SSII in classification. This? study? provides? a? basis? for? further? research? on? the? function? of jackfruit? sucrose? synthase? family members.

Keywords? jackfruit ; sucrose synthase ; bioinformatics analysis ; phylogenetic analysis

菠蘿蜜 （ Artocarpus heterophyllus Lam.）為?？?（ Moraceae）菠蘿蜜屬（ Artocarpus）植物，是世界著名的熱帶水果。其果實(shí)香氣濃郁，果肉味美甘甜，營(yíng)養(yǎng)豐富，有熱帶水果皇后之稱。

對(duì)大部分植物來說，蔗糖是重要的轉(zhuǎn)運(yùn)糖，是大部分非光合組織有機(jī)碳的重要來源，但蔗糖本身不能被直接利用，需被分解成可溶性單糖才能參與植物的各項(xiàng)生理代謝活動(dòng)。植物體內(nèi)存在蔗糖轉(zhuǎn)化酶 （ Invertase， INV）和蔗糖合成酶（ SS）2種分解蔗糖的酶， INV是將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，該反應(yīng)為不可逆反應(yīng); SS 則能在幾乎不消耗能量的前提下發(fā)生將蔗糖分解生成二磷酸尿苷-葡萄糖 （uridine diphosphate glucose， UDPG）與果糖的可逆反應(yīng)[1]。已有研究表明， SS 基因家族成員在調(diào)節(jié)蔗糖的分解與合成[2]、調(diào)控淀粉生物合成[3]、纖維細(xì)胞分化[4]、抗逆性提高[5]等方面發(fā)揮著重要的作用。

本研究采用 RACE 技術(shù)擴(kuò)增菠蘿蜜中的AhSS2基因全長(zhǎng)序列，對(duì)該基因的開放閱讀框和氨基酸序列進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析，以期為研究 AhSS2基因的功能及其體內(nèi)表達(dá)，進(jìn)一步揭示菠蘿蜜果實(shí)品質(zhì)形成機(jī)制以及菠蘿蜜的分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料

菠蘿蜜為廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院種植資源圃內(nèi)種質(zhì) B5-23，在果實(shí)成熟期，采摘鮮果，取樣后立刻用液氮冷凍保存于-80℃中以備后用。

1.1.2主要儀器設(shè)備

3H30R1智能高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）， AUY120島津電子分析天平（日本島津公司）， T1+/T1單槽 PCR儀（德國(guó)Biometra公司）， UV756CRT 型紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀表有限公司）， DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）， DYCP-31E 電泳槽（北京六一儀器廠）， Elix5超純水儀（美國(guó) Millipore公司）， YXQ-LS-100SII 型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅公司），恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，恒溫?fù)u床等。

1.2方法

1.2.1總 RNA 的提取和 cDNA 第一鏈的合成

菠蘿蜜果實(shí)的總 RNA 提取參照寶生物RNAiso- mate for Plant Tissue提取試劑盒說明書，按照寶生物 Prime ScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA第一鏈。

1.2.2菠蘿蜜AhSS2基因克隆

利用 RACE （rapid-amplification of cDNAends） 技術(shù)克隆了菠蘿蜜蔗糖合成酶基因（ AhSS2）的全長(zhǎng)序列。根據(jù)前期試驗(yàn)已經(jīng)得到的蔗糖合成酶基因中的保守序列，利用Primer Pre ‐mier 6.0軟件設(shè)計(jì)3RACE和5RACE 基因的特異性引物。3RACE擴(kuò)增體系總體積為20?L：MgCl21.2?L， dNTPs 2.0?L，10×PCR Buffer 2.0?L， cDNA溶液1.0?L，上游引物3GSP 0.2?L，下游引物 UPM 2.0?L，TaKaRa Taq 0.2?L，滅菌水11.4?L。PCR 反應(yīng)的條件：94℃5 min; 94℃1 min，72℃3 min，共5個(gè)循環(huán);94℃1 min，70℃50 s，72℃3 min，共32個(gè)循環(huán);72℃10 min;4℃1 h。5RACE 擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件同3RACE相同，引物為5GSP。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用鼎國(guó)生物 DNA快速回收/純化試劑盒，切膠進(jìn)行回收;通過 pMD19-T 載體進(jìn)行 T 載體連接，轉(zhuǎn)化至制備好的感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)單菌落，利用菌落 PCR篩選陽性克隆并送廣州生工生物科技有限公司測(cè)序。菠蘿蜜 AhSS2基因全長(zhǎng)擴(kuò)增體系總體積為20?L： MgCl21.2?L， dNTPs 2.0?L， 10×Taq Buffer with （ NH4）2SO42.0?L，cDNA溶液2.0?L，上游和下游引物共0.8?L，Taq 0.2?L，滅菌水11.8?L。 PCR擴(kuò)增條件：94℃4 min;94℃1 min，55～58℃50 s， 72℃1 min;共35個(gè)循環(huán)， 72℃10 min，4℃保存。按之前的步驟對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化、克隆，將其與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，從而得到基因的內(nèi)含子及外顯子序列。

1.2.3菠蘿蜜AhSS2基因的生物信息學(xué)分析

利用 NCBI 進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，利用 ORF finder 軟件尋找并預(yù)測(cè)菠蘿蜜 AhSS2基因的全長(zhǎng)序列開放閱讀框;使用 CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/docs/cdd_ search.html）在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析預(yù)測(cè);利用在線軟件ExpasyProtParam （https：//web.ex‐pasy. org/cgi-bin/protparam/protparam） 預(yù)測(cè)菠蘿蜜 AhSS2基因編碼蛋白理化性質(zhì);利用在線軟件 TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/servic ‐ es/TMHMM/）預(yù)測(cè)菠蘿蜜 AhSS2基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu);利用在線軟件NetPhos （http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/） 預(yù)測(cè)菠蘿蜜 AhSS2基因的磷酸化位點(diǎn);利用在線軟件ExPasy-ProtScale? （https：//web. expasy. org/ protscale/）預(yù)測(cè)菠蘿蜜 AhSS2基因的親疏水性;利用 SOPAM （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/secpred_sopma.pl）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行分析;使用 SWISS-MODEL 軟件預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu);采用 MEGA X 軟件的 Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1菠蘿蜜AhSS2基因克隆及序列分析

電泳結(jié)果顯示，28S 和18S 的條帶清晰完整（圖1），可用于下一步實(shí)驗(yàn)。將逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 第一鏈作為模板，進(jìn)行 RACE 擴(kuò)增，電泳結(jié)果見圖2-A （3端擴(kuò)增的目標(biāo)條帶）、圖2-B （5端擴(kuò)增的目標(biāo)條帶）。將目的條帶進(jìn)行膠回收純化，膠回收產(chǎn)物經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)行測(cè)序，得到目的基因序列，命名為 AhSS2;該基因包含一個(gè)長(zhǎng)為2436 bp 的開放閱讀框（open reading frame， ORF），位于148～2583 nt，共編碼811個(gè)氨基酸 （圖3）。

2.2菠蘿蜜AhSS2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，編碼氨基酸數(shù)量為811個(gè)，蛋白的相對(duì)分子量是92.583 ku，等電點(diǎn)pI為5.77，屬酸性蛋白質(zhì)，酸性氨基酸總數(shù)（Asp+Glu）為110，堿性氨基酸總數(shù) （Arg+Lys）為94。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為36.86，屬穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為90.17。親水性平均值（ GRAVY）為-0.259，屬于親水性蛋白。

2.3菠蘿蜜AhSS2基因編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域

使用 CDD在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)域（圖4）：一個(gè)是蔗糖合成酶位點(diǎn)，位于8～555 nt，該家族包括大部分的蔗糖合成酶蛋白，而蔗糖合成酶的羧基末端區(qū)域?qū)儆谔腔D(zhuǎn)移酶家族 IPR001296，該酶主要存在于植物中，但也出現(xiàn)在細(xì)菌中;另一個(gè)是糖基化轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)，位于558～745 nt，二糖、寡糖和多糖的生物合成有許多不同糖基轉(zhuǎn)移酶參與，這些酶催化了糖基從活性受體分子到特定受體分子間的轉(zhuǎn)移，形成糖苷鍵。

2.4菠蘿蜜AhSS2基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)、親疏水性

TMHMM對(duì)菠蘿蜜 AhSS2基因跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖5）。

ProtScale對(duì)基因的疏水性分析結(jié)果如圖6所示。正值越大，該區(qū)域疏水性越強(qiáng);負(fù)值越小，表明該區(qū)域親水性越強(qiáng)。菠蘿蜜的最大值為2.544，最小值為-3.011，為親水性蛋白，與ProtParam中的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果類似。

2.5菠蘿蜜AhSS2基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)利用在線軟件對(duì)上述蛋白氨基酸序列中的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，以 0.5為閾值，結(jié)果顯示，菠蘿蜜中共有113個(gè)磷酸化位點(diǎn)（圖7），其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（ serine，Ser）67個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（threonine，Thr）28個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（tyrosine，Tyr）18個(gè)，由此推測(cè)其生物功能是以絲氨酸磷酸化修飾調(diào)控為主。

2.6菠蘿蜜AhSS2基因的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.6.1蛋白二維結(jié)構(gòu)

利用 SOPA 預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8所示。圖中藍(lán)色曲線代表α-螺旋，綠色曲線代表β-折疊，紅色曲線代表突出鏈，紫色曲線代表無規(guī)則卷曲。分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有占比52.77%的α-螺旋、占比13.07%的延伸鏈、占比7.77%的β-折疊和占比為26.39%的無規(guī)則卷曲等4種構(gòu)象，據(jù)此推測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋。

2.6.2蛋白三維結(jié)構(gòu)

用 SWISS-MODEL 對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行 AhSS2基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖9所示。

2.7系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)進(jìn)化分析可將高等植物 SS基因分為3種類型，即 SS Ⅰ、SS Ⅱ、SSⅢ， SS Ⅰ又可分為單子葉組 （ Monocot SS Ⅰ） 和雙子葉組 （ Dicot SSⅠ）[6-9]。通過與擬南芥、水稻構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖10）發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜 AhSS2屬于 SSⅡ。

通過ClustalX對(duì)川桑、棗、核桃、葡萄的 SS2基因與菠蘿蜜 AhSS2基因進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用 MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖11）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜 AhSS2基因與核桃、葡萄的 SS2基因同源性以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近。

3討論

SS基因能夠參與蔗糖的代謝和運(yùn)輸，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與細(xì)胞壁的形成，對(duì)調(diào)控作物的品質(zhì)和產(chǎn)量也有重要作用。目前已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]、玉米（ Zea mays）[11]、番茄（Ly ‐copersicon esculentum）[12]、水稻（Oryza sati ‐va）[13]等多種植物中進(jìn)行了 SS基因研究。通過與擬南芥、水稻構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜 AhSS2屬于 SSⅡ。在同一植物中不同類型的 SS基因的表達(dá)具有發(fā)育、組織器官和功能特異性。

目前認(rèn)為，蔗糖合成酶基因含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域：蔗糖合成酶結(jié)構(gòu)域、糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域[14]，這與本研究結(jié)果相符。根據(jù) SS 與質(zhì)膜的緊密聯(lián)系以及跨膜預(yù)測(cè)分析[15]，研究人員假設(shè) SS 的一部分可能是跨膜的[16];另一方面，Amor等[17]得出結(jié)論，SS 不是跨膜蛋白， SS更可能與其他蛋白質(zhì)相互作用并形成與纖維素合成酶相關(guān)的復(fù)合物[18-19]。

蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)細(xì)胞功能起著重要的調(diào)控作用，它是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾之一[20]。SS 蛋白包含兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)，第一個(gè)是11至15處的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，主要在膜締合中起作用;第二個(gè)是170附近的一個(gè)絲氨酸，主要參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解[21]，這與本研究預(yù)測(cè)結(jié)果（ AhSS2基因的磷酸化位點(diǎn)主要為絲氨酸位點(diǎn)）相符。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，蔗糖合成酶蛋白的磷酸化會(huì)降低其與膜的關(guān)聯(lián)度[22]。

目前，在蔗糖合成酶基因的克隆、調(diào)控機(jī)制、生物學(xué)功能等分子生物學(xué)研究方面均取得了一定的進(jìn)展，但其參與調(diào)控蔗糖分配的機(jī)理仍不清楚，還需要做一系列更加深入的研究，方可利用其來調(diào)控植物產(chǎn)量和品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

[1] Geigenberger P，Stitt M. Sucrose synthase catal‐yses a readily reversible reaction in vivo in de ‐veloping potato tubers and other plant tissues [J].Planta，1993，189（3）：329-339.

[2] ZHOU L，Paull R E. Sucrose metabolism during Pa ‐ paya （ Corica papaya） fruit growth and ripening [J]. J Am Soc Hort Sci，2001，126（3）： 351-357.

[3] Li J，Baroja-Fernández E，Bahaji A， et al. En‐hancing sucrose synthase activity results in in‐ creased levels of starch and ADP glucose in maize （ Zea mays L.） seed endosperms [J]. Plant Cell Physiol，2013， 54（2）： 282-294.

[4] Xu S M， Brill E， Llewellyn D J， et al. Overex‐ pression of a potato sucrose synthase gene in cotton accelerates leaf expansion， reduces seed abortion， and enhances fiber production [J]. Mol Plant，2012，5（2）：430-441.

[5] Jha A B， Dubey R S. Carbohydrate metabolism in growing rice seedlings under arsenic toxicity [J].J Plant Physiol，2004，161（7）：867-872.

[6] Komatsu A，Moriguchi T， Koyama K， et al. Analy‐ sis of sucrose synthase genes in citrus suggests different roles and phylogenetic relationships [J]. Journal of Experimental Botany， 2002， 53（366）：61-71.

[7] Tatsuro H， Scofield G N，Tomio T， et al. An ex ‐ pression analysis profile for the entire sucrose synthase gene family in rice [J].Plant Science，2008，174（5）：534-543.

[8] Chen A Q， He S E， Li F F， et al. Analyses of the sucrose synthase gene family in cotton：struc‐ture，? phylogeny and expression patterns. BMC Plant Biology，2012，12（1）：85.

[9] Zou C S， Lu C R， Shang H H， et al. Genome-wide analysis of the Sus gene family in cotton [J]. J Integr Plant Biol，2013，55（7）：643-653.

[10] Zuzanna B，Barratt Paul D H，Garlick A P， et al.Analysis of the sucrose synthase gene family in Arabidopsis [J]. The Plant Journal， 2007， 49（5）：810-828.

[11] McCarty D R， Shaw J R， Hannah L C. The cloning， genetic mapping， and expression of the consti‐tutive sucrose synthase locus of maize [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1986，83（23）：9099-9103.

[12] Wang F，? Smith A G， Brenner M L. Isolation and sequencing of tomato fruit sucrose synthase cDNA [J]. Plant Physiology， 1993， 103（4）： 1463-1464.

[13] Hirose T， Scofield G N，Terao T. An expressionanalysis profile for the entire sucrose synthase gene family in rice [J]. Plant Science， 2008，174（5）：534-543.

[14]陳曙，趙秋芳，陳宏良，等.玉米蔗糖合成酶基因家族的全基因組鑒定及表達(dá)分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，32（11）：2479-2485.

[15]朱迎迎.百合鱗莖發(fā)育過程中蔗糖合成酶基因的功能研究[ D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[16] Carlson S J，Chourey P S. Evidence for plasma membrane-associated forms of sucrose synthase in maize [J]. Mol Gen Genet，? 1996， 252：303-310.

[17] Amor Y，Haigler C H，? Johnson S， et al. A mem ‐ brane-associated form of sucrose synthase and its potential role in synthesis of cellulose andcallose in plants [J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995， 92（20）：9353-9357.

[18] Persia D， Cai G， Del Casino C，? et al. Sucrosesynthase is associated with the cell wall of to ‐ bacco pollen tubes [J]. Plant Physiol， 2008，147：1603-1618.

[19] Mizuno K. Sucrose synthase is an integral compo ‐nent of the cellulose synthesis machinery [J]. Plant Cell Physiol，2010，51：294-301.

[20]阮班軍，代鵬，王偉，等.蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（7）：1027-1037.

[21] Hardin S C， Tang G Q， Scholz A，? et al. Phos‐phorylation of sucrose synthase at serine 170： occurrence and possible role as a signal for proteolysis [J]. Plant J， 2003， 35（5）：588-603.

[22]王俊明.水稻蔗糖合成酶家族基因的 OsSUS2、OsSUS3的功能研究[ D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2011.

（編輯排版：林海妹）