王維杰，趙森峰，2，曹家輝，2，李冰潔

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052，1.肝膽胰外五科，3.腫瘤科；2.鄭州大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河南 鄭州 450052）

胰腺癌是惡性程度最高的消化道惡性腫瘤之一，具有手術(shù)切除率低、轉(zhuǎn)移率高、復(fù)發(fā)率高以及對放化療不敏感的特性，預(yù)后極差[1-2]。研究表明，LAMA3（Laminin subunit alpha 3）基因編碼層粘連蛋白332（Laminin 332，LM-332）α亞基，在不同腫瘤中呈現(xiàn)不同的表達模式，低表達于胃癌、乳腺癌和前列腺癌等，但在肝癌、胰腺癌和鱗狀細胞癌中呈現(xiàn)高表達[3-6]。越來越多的證據(jù)表明，LAMA3的異常表達和甲基化與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，具有重要的靶向研究價值和生物學(xué)標志物意義[7-9]。但是，LAMA3在胰腺癌中的信號通路和預(yù)后評估的相關(guān)研究鮮有報道，因此，本研究基于TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫，明確LAMA3在胰腺癌中的表達情況，分析其與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性及其在預(yù)后中的評價作用，通過基因富集分析（gene sets enrichment analysis，GSEA）進一步預(yù)測其在胰腺癌中的信號通路，為研究LAMA3在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制提供新的理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)采集與處理

本研究中所涉及的胰腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和患者臨床數(shù)據(jù)來自于腫瘤基因組圖譜（the Cancer Genome Alas，TCGA）和基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫，主要利用生物信息學(xué)的方法進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。首先在TCGA數(shù)據(jù)庫分析LAMA3的差異表達，繼而采用Cox回歸分析與臨床病理特征的相關(guān)性，進而Kaplan-Meier分析與總生存期的關(guān)系。最后，在GEO數(shù)據(jù)庫進一步驗證LAMA3的差異表達和生存分析。

1.2 差異表達分析

采用limma R軟件包進行Wilcoxon檢測，探討LAMA3在正常組織和腫瘤組織中的差異表達（|lgFC|＞2且P＜0.01）。本研究利用179例腫瘤組織和4例非腫瘤組織的LAMA3表達數(shù)據(jù)進行差異表達分析，同時利用4對腫瘤組織和癌旁組織的LAMA3表達數(shù)據(jù)進行配對差異表達分析。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3 單因素和多因素Cox回歸分析

根據(jù)LAMA3 表達值的中位值，將患者分為高低兩組，將臨床數(shù)據(jù)和風險評分一起進行Cox分析，計算各臨床特征的HR和95%CI，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4 預(yù)后評價與Kaplan-Meier生存分析

根據(jù)LAMA3 表達值的中位值，將患者分為高低兩組。使用Survival R包繪制ROC曲線，同時計算AUC值，ROC曲線下的面積值在0～1之間。在AUC＞0.5的情況下，AUC越接近于1，說明診斷效果越好。AUC在0.5～0.7時有較低準確性，AUC在0.7～0.9時有一定準確性，AUC在0.9以上時有較高準確性。使用Kaplan-Meier方法對LAMA3 高低表達組的生存期進行分組比較，統(tǒng)計學(xué)方法選用Log-rank。在P＜0.05的情況下，不同分組的生存曲線離散度越高，表示LAMA3高低表達組的生存差異越大。

1.5 GSEA通路富集分析

從復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度出發(fā)，通過GSEA的方法，基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫，對基因集合進行基于KEGG數(shù)據(jù)庫的生物通路富集分析，從而提取出最相關(guān)的生物通路上的差異基因，更加有利于下游實驗的開展。

2 結(jié)果

2.1 LAMA3在胰腺癌中的差異表達和配對分析

使用edgeR R包分別計算TCGA數(shù)據(jù)庫中正常胰腺組織、癌旁和胰腺癌組織的差異表達，結(jié)果提示無論與正常組織還是癌旁組織相比，胰腺癌組織中LAMA3的表達均顯著增高（P＜0.05）（見圖1A、B）。GEO數(shù)據(jù)庫進一步驗證差異表達分析，結(jié)果提示LAMA3在胰腺癌組織中的表達高于正常組織（P＜0.05）（見圖1C）。

圖1 LAMA3在胰腺組織的表達情況

2.2 單因素和多因素Cox回歸分析

將TCGA數(shù)據(jù)庫胰腺癌的分級、淋巴結(jié)的侵犯轉(zhuǎn)移情況、TNM分期及腫瘤的大小等臨床性狀與LAMA3 的表達情況進行單因素Cox回歸分析，結(jié)果提示胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR2.26，P=0.003）和LAMA3 的表達（HR1.02，P=0.001）與預(yù)后生存相關(guān)（見表1）。進一步多因素Cox回歸分析結(jié)果提示胰腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR1.91，P=0.024）和LAMA3的表達（HR1.02，P=0.003）與預(yù)后生存相關(guān)，表明LAMA3 是胰腺癌一個重要的獨立預(yù)后因子（見圖2）。

表1 應(yīng)用單因素Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)中胰腺癌臨床病理特征與總體生存期的關(guān)系

圖2 多因素Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)中胰腺癌臨床病理特征與總體生存期的關(guān)系

2.3 LAMA3高表達的預(yù)后評價

根據(jù)LAMA3 表達的中位數(shù)將患者分為高表達組和低表達組，5 年總生存率的ROC曲線下面積為0.711（見圖3A），說明我們的模型可以很好地預(yù)測患者的生存情況。針對高表達組和低表達組的Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達組的總生存時間明顯長于高表達組（P＜0.01）（見圖3B）。我們通過GEO數(shù)據(jù)集GSE21501 進一步驗證LAMA3 高表達與胰腺癌的預(yù)后，結(jié)果與前一致（見圖3C）。綜上可見，LAMA3高表達是胰腺癌一個獨立的不良預(yù)后因子。

圖3 LAMA3相關(guān)ROC曲線及生存曲線

2.4 GSEA通路富集分析

基于KEGG生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫，對差異基因集合進行GSEA通路富集分析表明，p53信號通路、細胞周期、DNA復(fù)制、剪接體、蛋白酶體及氧化磷酸化在LAMA3高表達表型中富集；細胞因子-細胞因子受體相互作用和細胞黏附分子在LAMA3 低表達表型中富集，提示LAMA3高表達與胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移機制密切相關(guān)（見圖4）。

圖4 GSEA通路富集分析

3 討論

胰腺癌是消化道惡性程度最高的腫瘤，由于缺乏早期特異性的診斷標志物且腫瘤生物學(xué)行為進展迅速，確診為胰腺癌的患者大部分已屬晚期，常伴有早期轉(zhuǎn)移和廣泛的局部性擴散，僅20%的患者有外科手術(shù)根治性切除的機會，而接受系統(tǒng)性化療的晚期患者的中位生存期也只有8個月左右，因此，胰腺癌的5年總生存率在4%～5%[10-11]。此外，針對胰腺癌最常用的腫瘤標志物是CA199，然而CA199在疾病早期并沒有明顯升高，其敏感性和特異性也僅為70%[12-13]。因此，深入研究胰腺癌進展的分子機制并挖掘新的具有高特異性和敏感性的生物標志物是改善胰腺癌患者生存預(yù)后的重要措施之一[14]。

LAMA3是層粘連蛋白家族主要成員LM-332的編碼基因之一，研究發(fā)現(xiàn)，LAMA3在胃癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤中異常表達，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要影響[3-6]；另外，LM-332家族參與了胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和前列腺癌等惡性腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，尤其與胰腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[15-18]。然而，在胰腺癌中尚缺乏針對LAMA3的系統(tǒng)性分析和深度的機制挖掘。

本研究基于生物信息學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)性地分析了LAMA3 在胰腺癌中的差異表達，并多方面評估其過表達對胰腺癌預(yù)后的診斷價值。分析結(jié)果表明，LAMA3 在胰腺癌組織中的表達顯著高于正常和癌旁組織，過表達LAMA3 的胰腺癌患者總體生存期顯著減少。進一步單因素和多因素的Cox回歸分析證實，LAMA3 高表達可能是胰腺癌一個獨立的不良預(yù)后因子。Yang等[19]對層粘連蛋白基因家族在胰腺癌中的表達進行了全面的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LAMA3 在胰腺癌中顯著高表達并與其不良預(yù)后密切相關(guān)，聯(lián)合血清LAMC2和CA199水平可增加對早期胰腺癌患者的診斷效能。Kim等[20]聯(lián)合LAMA3、E2F7、IFI44、SLC12A2和LRIG1這5個功能基因構(gòu)建胰腺癌的預(yù)后模型，可有效改善胰腺癌的個體化治療策略，有望成為胰腺癌潛在的新藥物靶點。綜上可見，LAMA3很可能是胰腺癌的一個獨立預(yù)后因子，在胰腺癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

此外，DNA甲基化和RNA可變剪接等表觀遺傳修飾可調(diào)控LAMA3的表達，在乳腺癌、胃癌、膀胱癌和卵巢癌等的研究中證實LAMA3發(fā)生甲基化，具有腫瘤早期診斷意義[21]。LM-332由LNα3、LNβ3和LNγ2鏈組成，LAMA3是LNα3亞基的編碼基因。一方面，LNα3 鏈與其他多肽鏈組成層粘連蛋白，通過層粘連蛋白-受體互作活化黏著斑激酶，進而參與細胞信號傳導(dǎo)；另一方面，LNα3 鏈的缺失使得細胞無法聚集半橋粒，層粘連蛋白連接不上細胞骨架，導(dǎo)致細胞的黏附性降低。研究表明，LAMA3在乳腺癌、胃癌和膀胱癌中低表達致使LM-332 無法合成，使得上皮細胞易于脫離細胞外基質(zhì)，從而促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[21-22]。然而，目前尚不清楚LAMA3在胰腺癌組織高表達的具體作用機制。我們基于KEGG生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫，對差異基因集合進行GSEA通路富集分析表明，p53信號通路、細胞周期、DNA復(fù)制、剪接體、蛋白酶體及氧化磷酸化在LAMA3高表達表型中富集，而細胞因子-細胞因子受體相互作用和細胞黏附分子在LAMA3 低表達表型中富集，提示LAMA3在胰腺癌中過表達可能參與了癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，值得進一步深入的研究和證實。

綜上所述，LAMA3在胰腺癌中過表達可能是胰腺癌一個獨立的不良預(yù)后因子。過表達的LAMA3可能參與了胰腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移機制的調(diào)控，有望成為胰腺癌診治的新靶點和生物學(xué)標志物。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：王維杰負責課題設(shè)計、數(shù)據(jù)收集、資料分析、論文撰寫；趙森峰、曹家輝參與論文修改；李冰潔指導(dǎo)課題設(shè)計、論文撰寫及最后定稿。