康書紅，藺紅麗，趙霞

（1.安陽市人民醫(yī)院心胸外科，河南 安陽 455000；2.河南護理職業(yè)學?？蒲刑?，河南 安陽 455000；3.南陽醫(yī)學高等專科學校護理系，河南 南陽 473000）

食管癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，預(yù)后差，死亡率高[1]。盡管食管癌患者的治療效果有所改善，但總體5年生存率和食管切除術(shù)后5年生存率仍然很差[2]。研究表明，lncRNA（long non-coding RNA）是蛋白質(zhì)表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯后修飾的重要元素,它們可能是食管癌的新生物標志物和治療靶點[3]。lncRNARP11-351J23.1（LINC0 2487,ENST00000400831)在食管癌中顯著低表達[4],RP11-351J23.1 抑制口腔癌細胞侵襲和遷移[5],且與乳腺癌進展有關(guān)[6]。本研究通過生物信息學預(yù)測,發(fā)現(xiàn)RP11-351J23.1與miR-765 存在結(jié)合位點。miR-765在食管癌組織中顯著高表達，與食管癌進展有關(guān)[7]。miR-765 促進肝癌細胞的增殖[8]。但RP1 1-351J23.1和miR-765在食管鱗癌中是否存在調(diào)控關(guān)系還不清楚。本課題以食管鱗癌細胞Eca109為主要研究對象,假設(shè)lncRNA RP11-351J23.1 可通過靶向miR-765 調(diào)控Eca109細胞增殖、侵襲和遷移，并對此假設(shè)進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管鱗癌細胞株Eca109、KYSE150和EC9706細胞購自ATCC，正常食管上皮細胞HEEC 購自北納生物；RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）購自美國Gibco 公司，牛血清白蛋白（Bovine Serun Albumin,BSA）和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；Transwell 板購自美國Corning 公司；引物、RP11-351J23.1 過表達載體（pcDNA-RP11-351J23.1）、miR-765 mimics(miR-765)、miR-765 抑制劑(anti-miR-765)、陰性對照(pcDNA-control、miR-con和anti-miR-con)、lncRNA RP11-351J23.1 野生型（WT）和突變型（MUT）雙熒光素酶報告系統(tǒng)載體購自蘇州吉瑪基因；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、Total RNA 提取試劑盒、real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RT-PCR）購自寶生物工程（大連）有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)（Dual-Luciferase Reporter Assay System）購自美國Promega 公司；光學顯微鏡、全自動酶標儀、發(fā)光儀及Real-time PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人食管癌細胞株Eca109和KYSE150 培養(yǎng)在RPMI-1640 培養(yǎng)液中，EC9706和正常食管上皮細胞HEEC 培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中均添加10 % FBS、100U/ml 青霉素和100μg/ml 鏈霉素，在飽和濕度、37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，消化傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的Eca109細胞，培養(yǎng)液稀釋后以2×l05個細胞/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)至融合度達80%，根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：RP11-351J23.1 過表達組 (轉(zhuǎn)染pcDNA-control和pcDNA-RP11-351J23.1)，miR-765 抑制組（轉(zhuǎn)染anti-miR-con和anti-miR-765），miR-765 過表達組（轉(zhuǎn)染miR-con和miR-765），RP11-351J23.1和miR-765 過表達組(轉(zhuǎn)染pcDNA-RP11-351J23.1+miR-con和pcDNA-RP11-351J23.1+miR-765)及RP11-351J23.1野生型（WT）和突變型（MUT）雙熒光素酶報告系統(tǒng)載體組（分別轉(zhuǎn)染RP11-351J23.1（WT）+miR-con、RP11-351J23.1（WT）+miR-765、RP11-351J23.1（MUT）+miR-con和RP11-351J23.1（MUT）+miR-765），轉(zhuǎn)染48h，收集細胞，驗證無誤，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 Real-timePCR 檢測RNA的表達 收集食管癌Eca109、KYSE150和EC9706和正常食管上皮細胞HEEC，使用Total RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，參照real-time PCR 試劑盒說明書進行反應(yīng)合成miR-765和lncRNA RP11-351J23.1，反應(yīng)程序為：95℃5min；94℃30s、59℃40s、72℃45s，40 個循環(huán)；72℃5min。miR-765上游引物序列：5’-GTAGCCAAGGAATCCGAAGGA-3’，下游引物序列：5’-GCGAGGAAGGAGGAC GAAGGT-3’;lncRNA RP11-351J23.1 上游引物序列：5’-CTCACTGGCAATTGTCGTGGA-3’，下游引物序列：5’-CAGGCACCCTAATGCTGTGCT -3’。用2-ΔΔCt 方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 CCK8 實驗檢測細胞活力 收集轉(zhuǎn)染后的Eca109細胞（pcDNA-RP11-351J23.1 組、anti-miR-765 組和pcDNA-RP11-351J23.1+miR-765 組及對照組）,消化并稀釋，以2×103個細胞/孔（200μl/孔）接種于96 微孔板中,在細胞培養(yǎng)至48h 進行CCK8實驗，每孔加入10μl CCK8 溶液，置于37℃繼續(xù)培養(yǎng)2h，上酶標儀檢測450 nm 處的吸光度(A)值。

1.2.5 Transwell 實驗測定細胞侵襲和遷移 遷移實驗：收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Eca109細胞，用無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基過夜饑餓培養(yǎng)，用培養(yǎng)液稀釋至1×l06個細胞/ml，在Transwell 上層小室加入100μl 稀釋后的Eca109細胞，下層小室加入500μl 含10%FBS的RPMI-1640 培養(yǎng)基作為遷移趨化物，培養(yǎng)24h，取出后用棉簽拭去上層小室未遷移的細胞，甲醛固定遷移細胞，結(jié)晶紫染色，拍照，顯微鏡取10 個視野觀察遷移細胞并計數(shù)，計算平均值。侵襲實驗：將-20℃取出的Matrigel置4℃冰箱過夜液化，用4 ℃無血清培養(yǎng)基1:3 比例稀釋Matrigel，取100μl稀釋的Matrigel 加入Transwell 上層小室，37℃3h 使其固態(tài)化，以下步驟同遷移實驗。

1.2.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 根據(jù)1.2.2 方法進行Eca109細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建好的RP11-351J23.1 野生型（WT）和突變型（MUT）雙熒光素酶報告載體與miR-con 或miR-765 共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)好的Eca109細胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h，收集細胞并加入RIPA 裂解液重懸細胞，4℃過夜裂解細胞，然后離心收集裂解上清，檢測上清中的熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為對照，分析螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)均以均值±標準差（）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗，多組間比較采用單因素方差及兩兩比較LSD-t 檢驗進行分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA RP11-351J23.1和miR-765在食管癌細胞株中的表達與正常食管上皮細胞HEEC組相比，在食管癌Eca109、KYSE150和EC9706細胞中l(wèi)ncRNA RP11-351J23.1表達量均顯著降低（P<0.05），miR-765表達量均顯著升高（P<0.05）,見表1。lncRNA RP11-351J23.1和miR-765在三種食管癌細胞株中表達情況一致，選擇表達差異較大的Eca109細胞進行后續(xù)實驗。

表1 qRT-PCR 檢測不同食管癌細胞株中l(wèi)ncRNA RP11-351J23.1和miR-765的表達（，n=9）

表1 qRT-PCR 檢測不同食管癌細胞株中l(wèi)ncRNA RP11-351J23.1和miR-765的表達（，n=9）

注：與正常食管上皮細胞HEEC 組比較，*P<0.05。

2.2 過表達lncRNA RP11-351J23.1 抑制食管癌細胞Eca109 增殖、侵襲和遷移與pcDNA-control組相比，pcDNA-RP11-351J23.1 組Eca109細胞中l(wèi)ncRNA RP11-351J23.1表達量顯著升高(P<0.05)，細胞OD 值、侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)，Cyclin D1和MMP-2表達量顯著降低(P<0.05),見圖1、圖2和表2、3。說明lncRNA RP11-351J23.1 過表達可抑制Eca109細胞增殖、侵襲和遷移。

表2 過表達lncRNA RP11-351J23.1對Eca109細胞的活力、侵襲和遷移的影響（，n=9）

圖1 RP11-351J23.1 過表達對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達的影響

圖2 過表達lncRNA RP11-351J23.1對Eca109細胞的侵襲和遷移的影響（，n=9）

表3 RP11-351J23.1 過表達對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達的影響（，n=9）

表3 RP11-351J23.1 過表達對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達的影響（，n=9）

2.3 lncRNA RP11-351J23.1靶向miR-765,抑制miR-765的表達通過LncBase 網(wǎng)站預(yù)測到miR-765與lncRNA RP11-351J23.1 可能存在結(jié)合位點,見圖3；雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與miRcon 組相比,過表達miR-765 組lncRNA RP11-351J23.1 野生型（WT）的熒光素酶活性顯著下降（P<0.05），lncRNA RP11-351J23.1突變型（MUT）熒光素酶活性無變化，見表4；與pcDNA-control 組相比，過表達lncRNA RP11-351J23.1 組Eca109細胞中miR-765表達顯著下降（P<0.05），見表5。

表5 qRT-PCR 檢測Eca109細胞中l(wèi)ncRNA RP11-351J23.1的表達對miR-765表達的影響（，n=9）

表5 qRT-PCR 檢測Eca109細胞中l(wèi)ncRNA RP11-351J23.1的表達對miR-765表達的影響（，n=9）

圖3 lncRNA RP11-351J23.1與miR-765的結(jié)合位點

表4 雙熒光素酶活性檢測Eca109細胞中l(wèi)ncRNA RP11-351J23.1與miR-765的靶向關(guān)系（，n=9）

表4 雙熒光素酶活性檢測Eca109細胞中l(wèi)ncRNA RP11-351J23.1與miR-765的靶向關(guān)系（，n=9）

2.4 抑制miR-765的表達可抑制Eca109細胞活力、侵襲和遷移與anti-miR-con 相比，anti-miR-765 組miR-765表達降低（P<0.05），Cyclin D1和MMP-2表達顯著降低（P<0.05），細胞OD 值、侵襲和遷移細胞數(shù)均顯著降低（P<0.05），見圖4、圖5、表6和表7。說明抑制miR-765表達可抑制Eca109細胞增殖、侵襲和遷移。

表6 抑制miR-765的表達對Eca109細胞活力、侵襲和遷移的影響（，n=9）

表6 抑制miR-765的表達對Eca109細胞活力、侵襲和遷移的影響（，n=9）

表7 抑制miR-765的表達對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達的影響（，n=9）

表7 抑制miR-765的表達對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達的影響（，n=9）

圖4 抑制miR-765表達對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達的影響

圖5 抑制miR-765的表達對Eca109細胞侵襲(A)和遷移(B)的影響

2.5 過表達miR-765 逆轉(zhuǎn)lncRNA RP11-351J23.1對Eca109細胞活力、侵襲和遷移的抑制作用 為確認lncRNA RP11-351J23.1 是否通過miR-765調(diào)控Eca109細胞的增殖、侵襲和遷移，我們過表達RP11-351J23.1的同時過表達miR-765。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pcDNA-RP11-351J23.1+miR-con相比，pcDNA-RP11-351J23.1+miR-765 組miR-765表達升高（P<0.05），細胞OD 值、侵襲和遷移細胞數(shù)均顯著升高（P<0.05），Cyclin D1和MMP-2表達顯著升高（P<0.05），見圖6、表8和表9。說明過表達miR-765 可逆轉(zhuǎn)過表達lncRNA RP11-351J23.1對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用。

表8 過表達miR-765 逆轉(zhuǎn)RP11-351J23.1對Eca109細胞活力、侵襲和遷移的抑制作用（，n=9）

表8 過表達miR-765 逆轉(zhuǎn)RP11-351J23.1對Eca109細胞活力、侵襲和遷移的抑制作用（，n=9）

注：與pcDNA-RP11-351J23.1+miR-con 組比較，*P<0.05。

表9 過表達miR-765 逆轉(zhuǎn)RP11-351J23.1對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達的抑制作用（，n=9）

表9 過表達miR-765 逆轉(zhuǎn)RP11-351J23.1對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達的抑制作用（，n=9）

注：與pcDNA-RP11-351J23.1+miR-con 組比較，*P<0.05。

圖6 Western blot 檢測Eca109細胞中增殖、侵襲和遷移相關(guān)蛋白的表達

3 討論

食管癌是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢[9]。研究表明，食管癌患者組織和血漿中miRNA和lncRNA水平與患者生存和疾病進展密切相關(guān)，可作為食管癌的預(yù)后標志物和治療靶點[10]。RP11-351J23.1在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）去分化過程中發(fā)揮作用[11]。高表達RP11-351J23.1的OSCC患者存活時間更長，RP11-351J23.1 可能是反應(yīng)OSCC和舌鱗狀細胞癌（TSCC）預(yù)后的指標[12]。RP11-351J23.1在喉部鱗狀細胞癌（LSCC）[13]中也表達下調(diào)，具體作用尚不清楚。lncRNA RP11-351J23.1在食管癌中表達下調(diào)，具體作用尚不清楚[4]。本研究結(jié)果表明,與正常食管上皮細胞HEEC 組相比，lncRNA RP11-351J23.1在食管癌Eca109、KYSE150和EC9706細胞中表達均顯著下調(diào)，與上述研究結(jié)論[4]一致，過表達RP11-351J23.1 可抑制Eca109細胞增殖、侵襲和遷移。說明lncRNA RP11-351J23.1在食管癌的發(fā)展中起重要作用。

miR-765在多種腫瘤中表達異常，與腫瘤的進展有關(guān)，在TSCC 中，LINC00511與miR-765 相互作用，通過靶向LAMC2 調(diào)控TSCC的進展[14]。miR-765在黑色素瘤組織中表達上調(diào)，通過miR-765/FOXA2通路維持癌癥干細胞的特性，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用下促進黑色素瘤的存活[15]。miR-765在乳腺癌中表達明顯下調(diào)，與患者臨床分期相關(guān)[16]。研究表明，miR-765在食管癌組織中顯著高表達，其高表達與食管癌腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期顯著相關(guān)，可能是食管癌預(yù)后的標志物[7]。本研究結(jié)果表明，miR-765在食管癌Eca109、KYSE150和EC9706細胞中表達均顯著升高，與上述研究結(jié)論[7]一致，提示抑制miR-765表達可抑制Eca109細胞增殖、侵襲和遷移。

本研究通過LncBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lncRNA RP11-351J23.1和miR-765 存在結(jié)合位點，因此假設(shè)lncRNA RP11-351J23.1靶向miR-765 調(diào)控食管癌細胞的增殖、侵襲和遷移。本研究通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)及同時過表達miR-765和RP11-351J23.1發(fā)現(xiàn)，RP11-351J23.1靶 向miR-765 并可抑制miR-765的表達；過表達miR-765可逆轉(zhuǎn)過表達RP11-351J23.1對Eca109細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，驗證了研究之初的假設(shè)，兩者在食管癌中確實存在調(diào)控關(guān)系，與上述研究結(jié)果[7]共同證實miR-765在食管癌發(fā)展中的重要作用。

綜上,本研究結(jié)果表明，在食管鱗癌細胞系中，lncRNA RP11-351J23.1 下調(diào)，miR-765 上調(diào)。在食管鱗癌Eca109細胞中，lncRNA RP11-351J23.1通過靶向miR-765 調(diào)控Eca109細胞增殖、侵襲和遷移，過表達RP11-351J23.1 可抑制miR-765表達進而抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移。lncRNA RP11-351J23.1 是食管癌的潛在分子靶點。