吳建書，湯俊嶺

（1.洛陽市第五人民醫(yī)院口腔科，河南 洛陽 471000；2.河南省口腔醫(yī)院牙體牙髓科，河南 鄭州 450002）

目前，牙周炎的發(fā)病率較高，若治療不當[1]，可致牙周組織出現(xiàn)細菌感染，導(dǎo)致牙周軟組織損傷或甚至壞死，造成牙槽骨腐蝕[2]。因此，臨床治療牙周炎重要是促使缺損牙槽骨進行再生修復(fù)，使得損傷牙周組織恢復(fù)原來的生理功能，但傳統(tǒng)治療方式只能機械性修復(fù)牙周組織[3]，而不能刺激新組織生成及生長。

隨著細胞組織工程研究的深入發(fā)現(xiàn)牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLS Cs)與牙周組織的穩(wěn)定生長及缺損后的再生具有密切關(guān)系[4]，并可誘導(dǎo)牙周膜干細胞定向分化為牙骨細胞。研究證明，細胞外核苷酸受體家族成員P2X7受體可誘導(dǎo)機體分泌細胞因子分泌，對骨細胞和破骨細胞增殖或凋亡產(chǎn)生明顯的影響[5]，可能參與調(diào)控hPDLSCs 向牙骨細胞分化的生理過程。本文選擇筆者實驗團隊制備的牙原代培養(yǎng)hPDLSCs 作為實驗材料，選擇P2X7對該細胞進行干擾，旨在探討P2X7受體對hPDLSCs 分化中的影響作用，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 所有牙周膜均來自13～18 歲的健康個體10例，其中男性7例，女性3例，所有個體均有正畸需求而拔掉第一磨牙、第二磨牙和智齒而獲得新鮮牙周膜。本次研究符合醫(yī)學(xué)倫理，均與研究對象和其家長簽訂了知情同意書。

1.2 牙周膜干細胞原代培養(yǎng)方法 收集拔除時間<10min的無齲壞及根尖牙周炎患牙，置于75%酒精消毒后，滴入（羊抗兔及羊抗小鼠二抗，購自中國中杉金橋生物有限公司）雙抗的PBS 洗3 次，提取牙根中的牙周膜置入離心管，滴入630U/mlⅠ型膠原酶（美國Gibco 公司）+2.5U/ml Dispase（美國Gibco 公司）后輕晃混勻，37℃下消化反應(yīng)40 min，取出2000r/min 離心5min，棄上清。滴入培養(yǎng)基機械吹打均勻后,倒入潔凈培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于含2mmol/L 谷胺酰胺+100 U/ml 青霉素+100 mg/L 鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)液后，放入5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待傳代至90%，收集對數(shù)生長期內(nèi)的第一代牙周膜細胞，調(diào)整細胞密度1.0×103/ L～1.5×103/ L，機械吹打制備均勻細胞懸液，將其接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)12 h，對單個細胞貼壁孔進行標記，補液至200μl，待7d 后換液，倒置顯微鏡下觀察細胞增殖情況，若單孔細胞數(shù)≥100，滴入33%～50%后胰酶進行消化，轉(zhuǎn)移12 孔板進行擴大培養(yǎng)。

1.3 牙周膜干細胞細胞表型鑒定方法 選擇對數(shù)生長期轉(zhuǎn)代3 次牙周膜干細胞，滴入含2%胎牛血清PBS 制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×109/L，選取細胞懸液100μl 裝入1.5ml EP 管內(nèi)，放入溫水冰浴,于每個EP 管中滴入2μl 1:500 調(diào)配人CD34、CD45、CD29、CD105及CD146抗體（美國Sigma 公司提供），對照組滴入Alexa Fluor 標記小鼠IgG（美國Sigma 公司提供），4℃避光下孵育1h，滴入含2%胎牛血清PBS 洗3 次，滴入羊抗小鼠二抗10μl，孵育1h 避光，使用流式細胞儀測定牙周膜干細胞細胞表型。

1.4 實驗分組及成骨分化方法 將原代培養(yǎng)獲得的牙周膜干細胞細胞分為4 組，⑴A 組-對照組，選擇常規(guī)培養(yǎng)液處理；⑵B 組-三磷酸腺苷組，滴入100 nmol/L 三磷酸腺苷進行培養(yǎng)；⑶C 組-成骨誘導(dǎo)液組，滴入10%胎牛血清成骨誘導(dǎo)液，含10mol/L地塞米松+10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+50mg/L 抗壞血酸；⑷D 組-三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組，滴入100nmol/L 三磷酸腺苷、10%胎牛血清成骨誘導(dǎo)液，分別待培養(yǎng)7d、14d 時，滴入40mmol/L 茜素紅，選擇25℃染色10min，PBS 洗3 遍，選擇倒置顯微鏡觀察+拍照。

1.5 免疫細胞化學(xué)染色 將無菌載玻片置于6 孔板中，將密度為1×104/ml的h PDLSCs 滴加于載玻片上，37℃/5%CO2/飽和濕度下培養(yǎng)，6h 后補充液體至2.5ml；培養(yǎng)3d，細胞生長達75%左右時，取出玻片進行免疫細胞化學(xué)染色。

1.6 RUNX2、OCN基因表達和P2X7受體mRNA表達測定方法 分光光度儀定量分別測定四組總RNA，提取cDNA，real-time PCR測定RUNX2、OCN基因表達和P2X7受體mRNA表達，檢測儀器選取Supcycler PCR 儀，購自澳大利亞昆士蘭生物（中國）公司，檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。培養(yǎng)細胞至90%融合時靜止，收取細胞進行裂解，氯仿抽提后異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌采用DECP水溶后抽取2μg 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入PCR master MIX 擴增，條件為95℃預(yù)變性10min，95℃變 性20s，58.6℃退 火20s，72℃延 伸20s，30 個循環(huán)，從58.6℃與78℃直至99℃進行溶解曲線，片段長度231bp，儀器測定后自動形成熒光閾值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0，RUNX2 mRNA、OCN mRNA、P2X7受體mRNA 采用（）進行統(tǒng)計學(xué)描述，數(shù)據(jù)的對比采用方差分析和SNK-q 法；P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙周膜干細胞原代培養(yǎng)和克隆增殖 牙周膜組織原代培養(yǎng)在3 到5d 后，組織塊周圍游離出了密集的細胞以及組織塊外部稀疏的細胞。鏡下觀察細胞呈梭形的單層生長，細胞體豐滿，細胞漿均勻，細胞核清晰呈卵圓形；原代培養(yǎng)2 周后，細胞匯合度達到了80%，采用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)1周左右出現(xiàn)細胞克隆，即為PDLSCs（牙周膜干細胞）。見圖1。

圖1 PDLSCs 培養(yǎng)結(jié)果，A 為原代培養(yǎng)、B 為克隆培養(yǎng)，（100μm）

2.2 人牙周膜干細胞的細胞表型鑒定 流式細胞儀鑒定細胞表 面 CD34、CD45、CD105、CD29、CD146，其中鑒定PDLSCs的特異性標記物CD105、CD29、CD146 均為陽性表達，而造血細胞系表面標志CD34和白細胞共同抗原CD45 呈陰性表達。結(jié)果證實為人牙周膜干細胞。

2.3 各組細胞成骨分化情況 培養(yǎng)7d 牙周膜干細胞后，細胞排列有明顯的方向性，有些呈不規(guī)則形和多角形，多數(shù)呈梭形，見圖2。成骨誘導(dǎo)7d 左右，C 組D 組的實驗細胞性狀變?yōu)榉叫危@微鏡下可見灰白色鈣化小結(jié)節(jié)，茜素紅染色檢查結(jié)果顯示陽性，D 組檢出的鈣結(jié)節(jié)較C 組多且明顯(圖C)，在進行實驗時間14d 時，鏡下觀察可以發(fā)現(xiàn)，C 組的鈣結(jié)節(jié)主要表現(xiàn)為板層狀的圓形、橢圓形團塊，數(shù)量明顯多于D 組(圖D)。

圖2 A、B、C、D 分別為A 組、B 組、C 組、D組培養(yǎng)7d 后茜素紅染色結(jié)果（×200 倍）

成骨誘導(dǎo)7d 時，D 組RUNX2的表達明顯高于C 組，差異有顯著性意義(P<0.05)，A 組合B 租幾乎沒有變化；成骨誘導(dǎo)14d 時，D 組RUNX2的表達量與的7d 時比較，降低較為明顯，而C 組RUNX2 相對表達強度較7d 時增高顯著，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，A 組、B 組RUNX2 相對表達強度變化不顯著，見圖3。

圖3 A、B、C、D 組RUNX2表達量變化

2.4 免疫細胞化學(xué)染色 ⑴Stro-1和CD146的免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果均呈現(xiàn)陽性，胞漿呈棕黃色，細胞核呈藍色；證明h PDLSCs 能表達MSCs的表面標志物，見圖4。⑵Vim 染色：細胞呈棕黃色，定位在胞漿，核呈藍色，Vim（+）；CK 染色：核呈藍色，另外胞漿不著色，CK（-）；說明h PDLSCs 來自于外胚間充質(zhì)，而非上皮，見圖4。

圖4 hPDLSCs的免疫細胞化學(xué)染色 A Stro-1;B CD146;C Vim;D CK;（×200 倍）

2.5 各組牙RUNX2、OCN表達強度的比較在成骨后1 周和成骨后2 周成骨誘導(dǎo)液組和三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組RUNX2和OCN mRNA的表達均高于對照組和三磷酸腺苷組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；在成骨后1 周三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組的RUNX2和OCN mRNA表達高于成骨誘導(dǎo)液組，在成骨后2 周三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組的RUNX2和OCN mRNA表達低于成骨誘導(dǎo)液組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。成骨誘導(dǎo)液組成骨后1 周的RUNX2和OCN mRNA表達低于成骨后2 周，三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組成骨后1周的RUNX2和OCN mRNA表達高于成骨后2周，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組RUNX2、OCN 相對表達強度的比較（x±SD）

2.6 各組牙周膜干細胞P2X7受體mRNA表達的比較在成骨后1 周三磷酸腺苷組的P2X7受體mRNA表達（8.17±0.32）和三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組（8.78±0.22）均高于對照組（1.05±0.08）和成骨誘導(dǎo)液組（1.03±0.07），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），三磷酸腺苷組和三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組的P2X7受體mRNA 相對表達搶去的組間對比，差異無顯著性（P>0.05）；在成骨后2 周三磷酸腺苷組的P2X7受體mRNA表達（7.92±0.30）和三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組（3.52±0.53）均高于對照組（1.01±0.10）和成骨誘導(dǎo)液組（1.02±0.09），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），三磷酸腺苷組的P2X7受體mRNA表達高于三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；三磷酸腺苷組成骨后1 周的P2X7受體mRNA表達高于成骨后2周，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組牙周膜干細胞P2X7受體mRNA表達的比較（x±SD）

3 討論

牙周組織主要由牙周膜和牙槽骨等單元構(gòu)成[6]，其中研究顯示多種離子通道均可影響而hPDLSCs 促進牙周組成單元的發(fā)育分化[7]，因此，通過研究此類通道的作用機制，可使得hPDLSCs在可控范圍內(nèi)分化為能夠新生牙周組織細胞，從而修復(fù)牙周組織缺損。筆者通過參閱既往文獻發(fā)現(xiàn)，hPDLSCs和牙槽骨接觸程度緊密[8]，造成其具有明顯的成骨特性，可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煅拦羌毎?，促使牙槽骨再生，而多種因子均可誘導(dǎo)hPDLSCs 分化。研究顯示，P2X7受體能夠誘導(dǎo)骨骼干細胞分化成骨細胞，其屬于P2X受體蛋白家族一員[9]，并在高表達條件下被激活。其誘導(dǎo)骨骼干細胞分化的機制可描述為其和胞外三磷酸腺苷相互結(jié)合后，造成機體鈉離子、鈣離子內(nèi)流，而鉀離子外流[10]，誘發(fā)連鎖式的細胞數(shù)量變化。P2X7 廣泛存在于免疫細胞內(nèi)，可調(diào)控多種細胞及炎性因子分泌，造成細胞骨架重塑。文獻表明，P2X7受體能夠介導(dǎo)前列腺、結(jié)腸癌及甲狀腺惡性腫瘤產(chǎn)生及發(fā)展，并可刺激神經(jīng)系統(tǒng)釋放復(fù)雜生物信號[11]，對釋放神經(jīng)遞質(zhì)和膠質(zhì)細胞活化產(chǎn)生影響。

隨著研究深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)P2X7受體可誘導(dǎo)幼兒骨骼發(fā)育，引起骨骼干細胞分化成骨細胞，顯著影響骨骼發(fā)育及生長,同時其也可影響破骨細胞增殖和吸收[12]。因此,筆者選擇P2X7 干擾hPDLSCs分化成牙槽骨細胞，修復(fù)牙周組織缺損。既往研究認為三磷酸腺苷表達水平處于100nmol/L 時[13-15]，能夠使得P2X7 有效發(fā)揮促hPDLSCs 分化，筆者經(jīng)過本實驗前初步研究也認可該結(jié)論，實驗結(jié)果顯示，P2X7受體在hPDLSCs 分化過程中可顯著表達。

在本研究中分別測得各組Runx2和OCN基因表達，D 組的組Runx2和OCN基因表達顯著高于成骨誘導(dǎo)液組，提示輔加三磷酸腺苷可以加強hPDLSCs 分化為成骨細胞的能力。在本實驗中還發(fā)現(xiàn)外源性三磷酸腺苷對于hPDLSCs 分化調(diào)節(jié)具有階段性。筆者選擇Real-time PCR 檢測P2X7受體表達水平，三磷酸腺苷組和三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組mRNA 高于對照組與成骨誘導(dǎo)液組，提示了P2X7受體在外源性三磷酸腺苷影響下可以顯著表達，而其表達與hPDLSCs和成骨分化存在正相關(guān)關(guān)系。三磷酸腺苷+成骨誘導(dǎo)液組P2X7受體mRNA表達則低于三磷酸腺苷組，提示了hPDLSCs成骨效果受P2X7受體表達的影響。

綜上所述，P2X7受體可以明顯提高牙周膜干細胞的成骨效果，且三磷酸腺苷可以激活P2X7受體的表達。