楊曉艷，劉愛敏

（安陽市婦幼保健院婦產(chǎn)科，河南 安陽 455000）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是女性常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，發(fā)病率約為10%[1]，常以月經(jīng)不調(diào)、肥胖、不孕、閉經(jīng)及合并多系統(tǒng)代謝紊亂為主要臨床癥狀[2]，有研究報道[3]高雄激素血癥、胰島素抵抗（IR）是PCOS 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）是在胰島素刺激下負責外周組織攝取葡萄糖在葡萄糖轉(zhuǎn)運障礙介導的胰島素抵抗過程中起重要作用[4]。有研究報道[5]PCOS 病歷生理性改變主要表現(xiàn)為卵泡發(fā)育和閉鎖失衡，調(diào)節(jié)該動態(tài)過程的重要基因包括B細胞淋巴瘤-2（bcl-2）/Bax，Bax/Bax 異源二聚體增多使bcl-活性降低則可加速細胞凋亡，引起卵泡閉鎖等[6]。本研究選取2017年1 月至2019年6 月在我院治療的PCOS患者72例，其中合并胰島素抵抗患者40例（HOMAIR≥2.8），同時選取其他因素不孕患者50例作為對照組，對比分析兩組患者子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白及mRNA的水平差異，旨在確定Bcl-2、GLUT4對PCOS 診斷及是否合并IR 鑒別提供科學依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1 月-2019年6 月在我院治療的PCOS患者72例，其中合并胰島素抵抗患者40例（HOMA-IR≥2.8），納入標準：⑴PCOS診斷符合《婦產(chǎn)科學》中的標準；⑵無心、肝、腎、肺等重要臟器疾病；⑶患者知情同意。排除標準：⑴入組前3 個月有激素類藥物使用史；⑵有吸毒、藥物濫用史等不良嗜好者。同時選取月經(jīng)周期規(guī)律，因輸卵管狹窄等其他因素不孕患者50例作為對照組，PCOS 組和對照組年齡等一般資料比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 PCOS 組和對照組一般資料比較

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化染色 將子宮內(nèi)膜組織處理后制成石蠟包埋標本，并用4%多聚甲醛溶液固定3 d 以上，調(diào)整切片厚4μm，連續(xù)切片。5%多聚賴氨酸處理載玻片同時進行染色，直到出現(xiàn)棕黃色為止，顯微鏡下觀察照相。根據(jù)免疫顯色強度和陽性細胞密度進行標準分級。光學顯微鏡400 倍視野下計數(shù)各組中的總細胞及陽性細胞數(shù)，表達Bcl-2/GLUT4的細胞呈棕色，計算每組的平均陽性細胞率并照相。

1.2.2 RT-PCR 檢測 主要試劑、耗材：無水乙醇、氯仿、異丙醇購于廣州市化學試劑廠；裂解液緩沖液、PrimeScri p t TM RT Master Mix、PrimeScri p t TM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq TM

Trizol 法抽提與純化總RNA：trizol 法提取血清及組織總的RNA，并置于-80℃保存。

RNA 純度和濃度檢測：取1μl 總RNA 溶液,利用核酸蛋白定量儀測定吸光度值OD260/OD280比值和RNA 濃度,若比值范圍在1.8～2.0,表明純度符合要求。逆轉(zhuǎn)錄反應：以總RNA 為模板，按照大連寶生物TaKaRa 公司的RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，采用一次性20μl 標準逆轉(zhuǎn)錄反應體系。逆轉(zhuǎn)錄反應:以總RNA 為模板，按照大連寶生物TaKaRa 公司的RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，采用一次性20μl 標準逆轉(zhuǎn)錄反應體系。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS22.0 軟件，Bcl-2、GLUT4 等計量資料采用平均數(shù)±標準差表示，組間差異比較使用獨立樣本t 檢驗，相關性采用Pearson 分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCOS 組和對照組子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表達比較 PCOS 組子宮內(nèi)膜膜Bcl-2、GLUT4蛋白和mRNA表達明顯低于對照組（P＜0.05），見表2和圖1。

表2 PCOS 組和對照組子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表達比較

圖1 子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白免疫組化染色圖

2.2 PCOS 組有無胰島素抵抗患者子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表達比較 PCOS 組合并胰島素抵抗患者子宮內(nèi)膜膜Bcl-2、GLUT4蛋白和mRNA表達明顯高于無胰島素抵抗患者（P＜0.05），見表3。

表3 PCOS 組有無胰島素抵抗患者子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表達比較

2.3 PCOS 組不同年齡、體質(zhì)量指數(shù)患者子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表達比較 PCOS 組不同年齡、體質(zhì)量指數(shù)患者子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表4。

表4 PCOS 組不同年齡、體質(zhì)量指數(shù)患者子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表達比較

2.4 相關性分析 將PCOS 組子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4蛋白、mRNA表達進行相關分析,結果顯示：Bcl-2、與GLUT4蛋白呈正相關（r=0.300，P＜0.05）；Bcl-2和GLUT4 mRNA 呈正相關(r=0.317,P＜0.05)。

3 討論

PCOS 是臨床上常見的婦科內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，臨床癥狀大多表現(xiàn)為慢性無排卵、月經(jīng)失調(diào)、多毛、痤瘡等，但臨床表現(xiàn)同時存在較強的異質(zhì)性。超聲和組織學檢查可見雙側卵巢呈多囊性改變，病理改變可涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、代謝等多系統(tǒng)，范圍廣泛，可同時引起多系統(tǒng)的功能紊亂及卵巢局部調(diào)控失常[7,8]。尋找理想的病理研究模型以深入研究多囊卵巢綜合征發(fā)生發(fā)展機制，為其臨床治療提供新的思路是學者亟待解決的問題。目前關于高胰島素血癥和胰島素抵抗（IR）與PCOS 發(fā)生發(fā)展關系的研究是熱點和重點。子宮內(nèi)膜葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族成員中負責子宮內(nèi)膜細胞基礎糖需求的一員，受IR的影響[9]。有研究通過給予患者排卵藥物治療后盡管獲得較高排卵率但妊娠成功率依舊很低，可能與PCOS患者子宮內(nèi)膜缺陷有關[10]。本研究探討子宮內(nèi)膜GLUT4水平與PCOS 相關性，以評估子宮內(nèi)膜生理狀態(tài)與PCOS 發(fā)生發(fā)展的相關性。研究結果顯示，合并胰島素抵抗的PCOS患者組子宮內(nèi)膜GLUT4 弱表達。與既往研究報道一致[11,12]?？赡芘c子宮內(nèi)膜細胞分化和代謝異常有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，合并胰島素抵抗的PCOS患者較未合并IR的PCOS患者子宮內(nèi)膜處的GLUT4水平顯著降低。說明，胰島素抵抗參與子宮內(nèi)膜代謝異常過程，引起子宮內(nèi)膜功能性障礙，可解釋臨床上PCOS患者的著床失敗和低妊娠率。胰島素與其受體結合后誘導自身磷酸化，促進細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運葡萄糖的GLUT4 轉(zhuǎn)移至細胞膜上，促進葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運，為子宮內(nèi)膜生物學功能的發(fā)揮提供能量[13]。當胰島素與其受體結合異常，自身絲氨酸磷酸化水平受抑制，使絡氨酸激酶誘導葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的活性降低，子宮內(nèi)膜代謝所需能量不足，限制子宮內(nèi)膜生物學功能的發(fā)揮，子宮內(nèi)膜缺陷，最終導致著床失敗和低妊娠率，誘導PCOS的發(fā)生發(fā)展。

子宮內(nèi)膜細胞凋亡和增生的失調(diào)可能與子宮內(nèi)膜生理狀態(tài)關系密切,一旦子宮內(nèi)膜細胞增殖和凋亡動態(tài)平衡被打破，子宮內(nèi)膜的生長狀態(tài)會受影響，最終有可能抑制其生物學功能的發(fā)揮誘導PCOS的發(fā)生和發(fā)展。Bcl-2 是具有蛋白質(zhì)結構特點的細胞凋亡直接抑制因子，與促進細胞凋亡的Bax 直接可相互作用形成Bax/Bax、Bcl-2/Bcl-2 同源二聚體或Bax/Bcl-2 異源二聚體。若Bax/Bax 同源二聚體增多則會降低Bcl-2的活性，加入細胞凋亡。相反，若Bxl-2蛋白含量增加，Bcl-2/Bax 異源二聚體含量增多，使Bax/Bax 同源二聚體更加穩(wěn)定，最終表現(xiàn)為Bcl-2 活性，抑制細胞凋亡[14,15]。有研究報道[16,17]Bcl-2在卵巢GCT 中表達顯著低于正常組織，提示Bcl-2在卵巢GCT的發(fā)生發(fā)展機制中起著重要作用，同時由于Bcl-2 是線粒體凋亡通路中重要因子。故說明Bcl-2通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑，成為卵巢GCT 發(fā)生發(fā)展分子機制過程中的重要因素，有望成為卵巢GCT 生物學行為的標志。本研究結果顯示，PCOS患者較其它原因的不孕患者子宮內(nèi)膜膜Bcl-2水平顯著降低，且合并IR的PCOS患者較未合并IR的PCOS患者子宮內(nèi)膜膜Bcl-2水平顯著降低。與既往研究報道一致[18,19]。說明，Bcl-2 異常介導細胞凋亡通路異常，是PCOS 形成的重要分子機制，Bcl-2 可作為子宮內(nèi)膜凋亡狀態(tài)的反映指標。本研究結果顯示，Bcl-2與GLUT4表達間呈正相關，聯(lián)合兩指標水平變化的評估對PCOS 診斷具有重要意義。

綜上所述，PCOS患者子宮內(nèi)膜Bcl-2、GLUT4表達下調(diào)，可能與患者胰島素抵抗有一定關系，兩者間表達有正相關關系。