王雪蓮，張辰宇，馮曉敏，柏國明

1.北京懷柔醫(yī)院檢驗科，北京 101400；2.首都醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，北京100069

新型冠狀病毒肺炎是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的以肺部病變?yōu)橹鞯男掳l(fā)傳染病，也可引起消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，嚴重者可導致死亡[1]。SARS-CoV-2主要經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播。SARS-CoV-2感染的患者，包括無癥狀感染者均為傳染源，且人群普遍易感[2]。新型冠狀病毒肺炎流行形勢非常嚴峻，截止到2020年11月23號，新型冠狀病毒肺炎全球累計確診超5 888萬例，死亡破139萬例，所以做好SARS-CoV-2的實驗室檢查是非常重要和必要的。2020年3月3日發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》(以下簡稱“第七版方案”)[3]新增加了抗體血清學檢測作為診斷SARS-CoV-2感染的另一檢測手段，來彌補核酸檢測漏檢的風險。為保證檢驗結(jié)果可靠有效，對定量實驗進行方法學驗證是實驗技術(shù)要求中的重要一環(huán)[4]，依據(jù)ISO15189《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的專用要求》，參考有關(guān)文獻[5-7]，對安圖磁微粒化學發(fā)光儀AutoLumo A2000Plus檢測SARS-CoV-2抗體IgG和IgM的性能進行評價。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 儀器：安圖磁微?；瘜W發(fā)光儀AutoLumo A2000Plus；試劑：安圖公司配套使用的SARS-CoV-2抗體IgM和IgG試劑(簡稱安圖試劑)、質(zhì)控品和標準品，博奧賽斯生物公司SARS-CoV-2抗體IgM和IgG試劑(簡稱博奧賽斯試劑)。

1.2方法

1.2.1正確度分析 使用標準品低值和高值連續(xù)測試5次，取均值,看測定均值是否在標準品范圍內(nèi)。

1.2.2精密度分析 按照WS/T 492-2016指導進行評價；檢測低值和高值2個不同濃度的質(zhì)控品，每個濃度每天1批，每批重復測定5次，持續(xù)5批，每個質(zhì)控品獲得25個數(shù)據(jù)；對于所獲得的測定結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，計算變異系數(shù)(CV)。結(jié)果評價標準：批內(nèi)CV≤1/4允許總誤差(TEa)%；批間CV≤1/3 TEa%。

1.2.3最低檢出限 根據(jù)CNAS-GL038：2019《免疫定性檢驗程序性能驗證指南》規(guī)定。使用安圖試劑盒稀釋液稀釋最低檢出限標本，測定4批，每批重復測定5次，共計20個數(shù)據(jù)。結(jié)果評價標準：根據(jù)CNAS-GL038：2019《免疫定性檢驗程序性能驗證指南》和《EP09-A2》規(guī)定進行。如果≥95%的標本檢出陽性，檢出限驗證通過。

1.2.4參考區(qū)間 選取40例健康者作為參考個體，年齡18～55歲，無既往病史，排除用藥，無SARS-CoV-2疫苗注射史，各項化驗指標均正常。標準要求：若40例參考個體中不超過2個觀測值在原始報告的參考限之外，廠商提供參考區(qū)間可以接受[8]。若3個以上觀測值超出界限，另選擇40例參考個體進行驗證，若≤2個觀測值超過原始參考限，則廠商提供參考區(qū)間可以接受；若仍有3個觀測值超出參考限，則應重新檢查所用分析程序，考慮2個標本總體生物學特征上是否存在差異，并考慮建立自己的參考區(qū)間。

1.2.5干擾試驗 主要驗證AutoLumo A2000Plus對溶血、黃疸、脂血的抗干擾能力[9]。取20份患者標本，包括10份陰性標本和10份陽性標本(S/CO>8)。將每份血清標本分成3份即60份標本，平均分3組，每組20份標本。干擾物濃度配制：血紅蛋白1 000 mg/dL、膽紅素50 mg/dL、三酰甘油6 000 mg/dL，比較加入干擾物前后S/CO均值的結(jié)果。

1.2.6攜帶污染率驗證 使用與儀器配套的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)試劑對高濃度質(zhì)控品、稀釋后的樣品及零濃度樣品進行檢測，計算攜帶污染率，如污染率均小于1×10-6，驗證結(jié)果符合要求。具體驗證程序：使用與儀器配套的HBsAg試劑進行檢測；用高于最低檢出限106倍的該項目質(zhì)控品作為原液；原液為樣品，在測定儀上測定原液的濃度值。重復測定10次，計算10次濃度的平均值，即為原液的原始濃度值。若因設(shè)備或試劑盒線性范圍限定而使得系統(tǒng)無法準確檢測質(zhì)控品濃度值，則可采用稀釋推算法獲得。例如：某一質(zhì)控品經(jīng)過100倍稀釋后濃度值為10 000 ng/mL則原始濃度值為106ng/mL。以原液和零濃度為樣品，按照原液、零濃度樣品、零濃度樣品、零濃度樣品的順序為一組，在測定儀上測定上述樣品的濃度值，共進行5組測定；每一組的測定中，原液的原始濃度值為L原，第2個樣品的濃度值為Li2，第4個樣品的濃度值為Li4，i為該測定組的序號；按照公式Ki=(Li2-Li4)/(L原-Li4)計算攜帶污染率。

1.2.7化學發(fā)光法檢測結(jié)果 使用安圖試劑及博奧賽斯試劑分別對40例SARS-CoV-2疫苗接種人員進行檢測，并將檢測結(jié)果做比較分析。檢測結(jié)果判定標準：S/CO=待測標本發(fā)光值/Cutoff值,S/CO≥1.00時，結(jié)果判為陽性；S/CO≤1.00時，結(jié)果判為陰性。

2 結(jié) 果

2.1正確度驗證結(jié)果 使用安圖標準品低值和高值連續(xù)測試5次，實測均值均在標準品范圍內(nèi)，見表1。

表1 SARS-CoV-2抗體IgM和IgG標準品范圍及正確度驗證結(jié)果

2.2精密度驗證結(jié)果 SARS-CoV-2抗體IgM和IgG質(zhì)控品低值和高值的批內(nèi)和批間精密度均在預期的目標CV內(nèi)，見表2。

表2 SARS-CoV-2抗體IgM和IgG質(zhì)控品精密度測定結(jié)果

2.3最低檢出限驗證結(jié)果 SARS-CoV-2抗體IgM和IgG 100%的標本檢出陽性，驗證結(jié)果符合要求，見表3。

表3 SARS-CoV-2抗體IgM和IgG最低檢出限測定結(jié)果

2.4參考區(qū)間及干擾試驗驗證結(jié)果 40例參考個體的SARS-CoV-2抗體IgM和IgG S/CO觀測值均在廠商提供的參考區(qū)間內(nèi)(S/CO≤1.00)，故廠商提供的參考區(qū)間可以接受。加入血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油干擾前后S/CO均值結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，干擾試驗驗證通過，見表4。

表4 干擾試驗結(jié)果比較

2.5攜帶污染率驗證結(jié)果 采用稀釋推算法測定原液的濃度值，將HBsAg原液稀釋100倍，重復測定10次，結(jié)果為300.562、340.558、276.836、315.432、320.135、314.974、384.294、350.626、365.501、312.865 IU/mL，原液稀釋100倍的平均值為328.178 3 IU/mL，計算原液的原始濃度為32 817.83 IU/mL。以稀釋原液和零濃度為樣品，按照稀釋原液、零濃度樣品、零濃度樣品、零濃度樣品的順序為一組，經(jīng)測定，5組攜帶污染率均小于1×10-6，符合要求，見表5。

表5 攜帶污染率驗證結(jié)果

2.6安圖試劑及博奧賽斯試劑檢測結(jié)果比較 使用安圖試劑和博奧賽斯試劑分別對40例SARS-CoV-2疫苗接種人員進行SARS-CoV-2抗體IgM和IgG檢測，2種試劑檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表6。

表6 安圖試劑及博奧賽斯試劑檢測結(jié)果比較[n(%)]

3 討 論

檢測出SARS-CoV-2核酸雖然是疑似病例確診的“金標準”，但是假陰性是核酸檢測最突出的問題。SARS-CoV-2抗體的檢測可以有效地彌補核酸檢測漏檢的風險?？贵w血清學檢測與核酸檢測相比，操作簡單、快捷，且標本質(zhì)量有保證，檢測耗時短，可實現(xiàn)自動化、大批量分析，無需對患者進行咽拭子采樣，也可降低醫(yī)護人員暴露風險[10-11]。目前對SARS-CoV-2抗體的檢測主要有膠體金法和化學發(fā)光法。膠體金法其優(yōu)勢在于檢測時間短、成本低、無需借助儀器即可判讀結(jié)果，但只能對抗體進行定性檢測，無法實現(xiàn)精確定量?；瘜W發(fā)光法是將高靈敏度的化學發(fā)光測定技術(shù)與高特異度的免疫反應相結(jié)合的檢測分析技術(shù)[12]，具有特異度高、線性范圍寬、結(jié)果穩(wěn)定、操作自動化、速度快等優(yōu)點，臨床上廣泛用于對各種抗原、抗體、激素、酶等的檢測[13]。

ISO15189認可中規(guī)定，實驗室對新購置的儀器，遇到重大投訴，重要零件及試劑更換后均需要對儀器的主要性能指標進行驗證，從而保證檢驗結(jié)果的準確可靠。經(jīng)過周密的實驗設(shè)計，本實驗室從正確度、精密度、最低檢出限、參考區(qū)間、抗干擾能力及攜帶污染率幾方面對AutoLumo A2000Plus檢測SARS-CoV-2抗體的性能進行了驗證。結(jié)果顯示：對標準品低值和高值各進行5次測試，實測均值在標準品范圍內(nèi)，正確度驗證合格。精密度是方法學評價的基礎(chǔ)，是性能驗證中最基礎(chǔ)的一項指標，也是檢測系統(tǒng)的基本分析性能之一，因此對精密度的驗證必不可少[14-15]。本試驗SARS-CoV-2抗體IgM和IgG質(zhì)控品批內(nèi)預期目標CV≤6.25%，批間預期目標CV≤8.33%。經(jīng)檢測，SARS-CoV-2抗體IgM低值、高值的批內(nèi)精密度分別為2.55%和2.33%，批間精密度分別為3.21%和2.90%，SARS-CoV-2抗體IgG低值、高值的批內(nèi)精密度分別為3.23%和2.21%，批間精密度分別為4.07%和2.81%，SARS-CoV-2抗體IgM和IgG低值、高值質(zhì)控品均符合預期目標CV要求。選用20份弱陽性標本進行最低檢出限驗證，本試驗100%的標本均能檢出，最低檢出限驗證符合要求。選用的40例參考個體的觀測值均在廠商提供原始參考區(qū)間內(nèi)，參考區(qū)間可以接受。選用20份患者標本加入干擾物前后進行測定，S/CO均值結(jié)果差異不大，對溶血、黃疸、脂血的抗干擾能力符合該試劑規(guī)定要求。攜帶污染率試驗可評價檢測結(jié)果是否受到上一標本的影響，且攜帶污染率為一個常數(shù)，不受前后2標本濃度差值大小的影響，能有效反映檢測系統(tǒng)攜帶污染的可能[16-17]。本試驗5組測定的攜帶污染率均小于1×10-6，符合要求，證明該儀器的加樣系統(tǒng)不受前后2標本濃度差值大小的影響。使用安圖試劑和與博奧賽斯試劑分別對40例SARS-CoV-2疫苗接種人員進行SARS-CoV-2抗體IgM、IgG檢測，2種試劑檢測結(jié)果分別相差1例，說明2種試劑符合性比較好。

綜上所述，AutoLumo A2000Plus檢測SARS-CoV-2抗體IgM和IgG性能良好，可滿足本實驗室需求，能夠在新型冠狀病毒肺炎的防控及診治中發(fā)揮作用。