李鵬飛 周林 何玉秀* 賈楠 梁軍偉 王金星

1. 河北師范大學(xué)體育學(xué)博士后流動站，河北 石家莊 050024 2. 河北醫(yī)科大學(xué)附屬哈勵遜國際和平醫(yī)院脊柱骨科，河北 衡水 053000

骨質(zhì)疏松癥為常見慢性疾病，主要影響骨骼運動系統(tǒng)[1]。雙膦酸鹽類藥物可明確抑制骨吸收[2]。其中，唑來膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸均為靜脈應(yīng)用[3]。但是目前尚無針對三者進行綜合比較的基礎(chǔ)研究。同時對于如何選擇合適劑量的雙膦酸鹽類藥物預(yù)防與治療骨質(zhì)疏松癥亦存在分歧[4]。針對上述問題，本研究擬通過基礎(chǔ)實驗明確三者對破骨細胞分化、形成、粘附及遷移作用的抑制特點，繪制濃度與抑制作用曲線，找到藥物最低有效濃度及50 %有效濃度。對于指導(dǎo)臨床選擇合適種類和劑量的雙膦酸鹽類藥物，具有一定的研究意義和價值。

1 材料與方法

1.1 材料

唑來膦酸(瑞士諾華制藥，注冊證號H20090259，5 mg)；伊班膦酸(河北醫(yī)科大學(xué)生物制藥中心，國藥準字H20163325，1 mg)；帕米膦酸(天吉生物制藥，國藥準字H20067706，15 mg)。C57小鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。集落刺激因子-1(Abcam, CSF-1)、NF-κB受體活化因子(Abcam, RANKL)。胎牛血清(Sigma Aldrich，F(xiàn)BS)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Sigma Aldrich，TRAP)。0.5 %四硼酸鈉、1 %甲苯胺藍；培養(yǎng)基(α-MEM，GIBCO BRL)、預(yù)濕牙本質(zhì)片(Windham)。纖維蛋白降解產(chǎn)物、磷酸鹽緩沖液。10 %甲醛、乙醇丙酮混合液；8 μm孔徑濾網(wǎng)(Transwell系統(tǒng)，24孔板)；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯)。QCapture-Pro(QImaging)、Imaging-Pro圖像處理(Media Cybernetics)、SPSS19.0統(tǒng)計軟件(IBM)等。

1.2 方法

1.2.1實驗用破骨細胞的制備：本研究依照動物倫理學(xué)要求，自小鼠四肢長骨骨干髓腔內(nèi)提取分離出骨髓單核細胞。采用α-MEM將培養(yǎng)3 d后，分化獲得破骨細胞(osteoclasts, OCLs)。之后將OCLs分為唑來膦酸組、伊班膦酸組、帕米膦酸組、對照組。于唑來膦酸組加入階梯濃度為10-3、10-2、10-1、1、10、102、103μmol/L唑來膦酸溶液[5]。同時，伊班膦酸組、帕米膦酸組分別加入相同階梯濃度的伊班膦酸和帕米膦酸溶液，對照組則加入磷酸鹽緩沖液。

1.2.2分化形成檢測：將OCLs繼續(xù)培育5 d后進行TRAP染色，倒置顯微鏡下觀察并拍攝；應(yīng)用Imaging-Pro軟件計算TRAP陽性細胞數(shù)量。

1.2.3遷移性檢測:應(yīng)用8 μm孔徑Transwell系統(tǒng)分析并測量OCLs活動性。三組分別加入相同階梯濃度的相對應(yīng)的實驗藥物(同1.2.1)，對照組加入同等量磷酸鹽緩沖液；仔細分出相同量OCLs，加于Transwell系統(tǒng)濾網(wǎng)，觀察通過濾網(wǎng)的細胞數(shù)量，并進行拍攝記錄。

1.2.4附著性檢測：離心沉淀骨髓單核細胞接種于96孔培養(yǎng)板。三組分別加入相同階梯濃度的相對應(yīng)的實驗藥物(同1.2.1)，對照組加入同等量磷酸鹽緩沖液。培育40 min后應(yīng)用磷酸鹽緩沖液沖洗去掉游離OCLs。通過倒置顯微鏡觀察記錄附壁OCLs并計算數(shù)量。

1.2.5骨吸收性檢測：將骨髓單核細胞接種于培養(yǎng)板并放置骨片。三組分別加入相同階梯濃度的相對應(yīng)的實驗藥物(同1.2.1)，對照組加入同等量磷酸鹽緩沖液。培育5 d后用磷酸鹽緩沖液沖洗去掉骨板上破骨細胞。用四硼酸鈉與甲苯胺藍染色后觀察記錄OCLs骨吸收陷窩形態(tài)，并計算骨陷窩數(shù)量及分布面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(Mean ± SEM)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。分布采用多樣本t檢驗、重復(fù)測量方差分析，Tukey Kramer方法進行組間統(tǒng)計分析。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 階梯濃度唑來膦酸抑制特征分析

與對照組相比，唑來膦酸在1 μmol/L濃度下，抑制破骨細胞分化、形成、活動、附著以及骨破壞功能明顯。此濃度下每高倍視野(HPF)分化形成破骨細胞平均數(shù)量明顯減少至(6.1±3.9)個，1 μmol/L為唑來膦酸最低有效抑制濃度(P<0.05, 見表1)。以對照組為基數(shù)，將數(shù)據(jù)綜合換算為百分比(Y軸)，制作階梯濃度對數(shù)表(X軸)，繪制階梯濃度抑制曲線圖。觀察曲線形態(tài)發(fā)現(xiàn)：10-1μmol/L ～ 1 μmol/L濃度抑制曲線走形陡峭，1 μmol/L為“扳機”濃度。隨著梯度濃度增加，在10、102、103μmol/L并未出現(xiàn)抑制作用明顯增強(P>0.05，見表1和圖1)。通過計算得出50 %有效濃度為0.66 μmol/L。

圖1 階梯濃度唑來膦酸對于體外培養(yǎng)OCLs抑制曲線圖Fig.1 Characteristic curve of different concentrations of zoledronate suppress osteoclasts in vitro

表1 階梯濃度唑來膦酸對體外培育OCLs抑制作用比較(Mean ± SEM)Table 1 Comparison of suppressed effects of different concentrations of zoledronate on osteoclasts(Mean ± SEM)

2.2 階梯濃度伊班膦酸抑制特征分析

伊班膦酸最低有效抑制濃度為10 μmol/L(P<0.05)。但是，各濃度伊班膦酸對破骨細胞附著性影響無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。繪制出階梯濃度伊班膦酸抑制曲線可見：1 μmol/L ～ 10 μmol/L濃度抑制曲線陡降，10 μmol/L為伊班膦酸抑制破骨細胞的“扳機”濃度。但是，隨著伊班膦酸濃度梯度進一步增加，對破骨細胞分化形成抑制曲線坡度逐漸減緩，抑制作用僅稍加強(P>0.05，見表2和圖2)。50 %有效濃度為5.58 μmol/L。

表2 階梯濃度伊班膦酸對體外培育OCLs抑制作用比較(Mean ± SEM)Table 2 Comparison of suppressed effects of different concentrations of ibandronate on osteoclasts(Mean ± SEM)

圖2 階梯濃度伊班膦酸對于體外培養(yǎng)OCLs抑制曲線圖Fig.2 Characteristic curve of different concentrations of ibandronate suppress osteoclasts in vitro

2.3 階梯濃度帕米膦酸抑制特征分析

帕米膦酸最低有效抑制濃度為102μmol/L(P<0.05)。但是，與對照組相比，各濃度帕米膦酸對破骨細胞附著性影響無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表3)。繪制出階梯濃度帕米膦酸抑制曲線提示：10 μmol/L ～ 102μmol/L濃度抑制曲線陡降，102μmol/L為帕米膦酸抑制破骨細胞的“扳機”濃度。但是，隨著帕米膦酸濃度梯度進一步增加，103μmol/L高濃度下，抑制作用沒有出現(xiàn)明顯增強(P>0.05，見表3和圖3)。其50 %有效濃度為51.9 μmol/L。

表3 階梯濃度帕米膦酸對體外培育OCLs抑制作用比較(Mean ± SEM)Table 3 Comparison of suppressed effects of different concentrations of pamidronate on osteoclasts(Mean ± SEM)

圖3 階梯濃度帕米膦酸對于體外培養(yǎng)OCLs抑制曲線圖Fig.3 Characteristic curve of different concentrations of pamidronate suppress osteoclasts in vitro

2.4 唑來膦酸、伊班膦酸與帕米膦酸抑制作用組間比較

基于上述數(shù)據(jù)，首先針對破骨細胞活性、遷移性以及骨破壞性方面進行組間比較。在10-3、10-2、10-1μmol/L濃度下，三者抑制作用沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對1 μmol/L濃度抑制作用進行組間比較，有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。唑來膦酸抑制破骨細胞作用明顯強于伊班膦酸與帕米膦酸(P<0.05，見圖4)。達到10 μmol/L濃度時，唑來膦酸與伊班膦酸比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而伊班膦酸抑制作用優(yōu)于帕米膦酸(P<0.05)。在102、103μmol/L高濃度下，三者抑制作用比較沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。三種藥物“扳機”濃度下進行組間比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其次，在粘附性抑制方面組間比較，各濃度伊班膦酸與帕米膦酸之間均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但是1、10、102、103μmol/L唑來膦酸抑制粘附性作用均明顯強于相同濃度伊班膦酸與帕米膦酸(P<0.05)。

圖4 1 μmol/L濃度唑來膦酸、伊班膦酸與帕米膦酸對OCLs抑制作用比較Fig.4 Comparison of inhibitory effects of 1 μmol/L zoledronate, ibandronate and pamidronate on OCLs

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是高發(fā)性老年疾病，多表現(xiàn)為骨痛。目前老年人胸腰椎骨質(zhì)疏松性壓縮骨折、轉(zhuǎn)子間骨折逐漸多見[6]。因此，需要積極預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥[7]。雙膦酸鹽類藥物在預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥的臨床方面應(yīng)用普遍[8]。值得注意的是，雙膦酸鹽類藥物是一把雙刃劍，使用過程中存在發(fā)熱、下頜骨壞死、腎功能損傷等不良反應(yīng)[9]。如何發(fā)揮其最大藥效，同時降低不良反應(yīng)發(fā)生率具有重要研究意義[10]。因此，本研究對三種藥物預(yù)防及治療骨質(zhì)疏松癥的方法、療程、用量及其對于破骨細胞抑制作用特點進行詳細分析并闡述。

高濃度伊班膦酸可有效抑制破骨細胞，阻止骨質(zhì)破壞[11]。這種作用亦隨著雙膦酸鹽類藥物使用劑量的增大而增加[12]。但是，應(yīng)用同樣高濃度的雙膦酸鹽類藥物-唑來膦酸治療，不會進一步提高療效，反而引起嚴重藥物不良反應(yīng)[13]。課題組深入分析發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸抑制破骨細胞的作用特征明顯不同。首先，實驗發(fā)現(xiàn)1 μmol/L為唑來膦酸最低有效抑制濃度，隨著梯度濃度進一步增加，在10、102、103μmol/L并未出現(xiàn)抑制作用明顯增強。證明大劑量應(yīng)用唑來膦酸后，未能再進一步提高臨床療效。而血漿高濃度唑來膦酸卻可能引起明顯不良反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛以及腎功能損傷等癥狀及臨床表現(xiàn)。提示臨床用藥量需要結(jié)合臨床實際，針對不同疾病、病情及患者肝腎功能等實際情況，合理用藥。

2018年，F(xiàn)DA與加拿大衛(wèi)生部公布在唑來膦酸治療中出現(xiàn)下頜骨壞死癥狀以及具有導(dǎo)致腎功能衰竭的風(fēng)險。因此，關(guān)于如何避免雙膦酸鹽類藥物不良反應(yīng)的研究被提上日程[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)唑來膦酸臨床應(yīng)用劑量已經(jīng)超過其最低有效劑量。同時，國外學(xué)者[17]提示臨床應(yīng)用4 mg、5 mg甚至8 mg唑來膦酸可能引起下頜骨壞死及腎功能衰竭等嚴重并發(fā)癥。為避免唑來膦酸帶來的嚴重不良反應(yīng)，建議臨床應(yīng)用盡量不超過4 mg。大劑量使用將導(dǎo)致體內(nèi)藥物濃度增加，增加腎臟清除負擔(dān)，影響正常骨骼代謝。必須通過改變唑來膦酸的使用方法、調(diào)整單次應(yīng)用劑量、適當延長間隔時間來降低及避免其不良反應(yīng)的發(fā)生。同時，關(guān)于伊班膦酸及帕米膦酸應(yīng)用的研究被再次提上日程[18-19]。伊班膦酸的腎損害風(fēng)險、頜骨壞死風(fēng)險及流感樣癥狀發(fā)生率均遠低于唑來膦酸[20-21]。與唑來膦酸及伊班膦酸比較，帕米膦酸抑制破骨細胞能力較弱，其優(yōu)點是不良反應(yīng)較輕且短暫，可以應(yīng)用于肝功能輕度損傷患者，但是對于腎功能損害患者則需要酌情減少使用劑量。

綜上所述，隨著唑來膦酸應(yīng)用劑量的增大，其藥效并不能夠明顯增強。適當減少使用劑量，不良反應(yīng)可以降低，而對治療效果的影響卻不明顯。在某種程度上，伊班膦酸、帕米膦酸可以替代唑來膦酸，達到有效治療骨質(zhì)疏松癥的作用。臨床工作中可以依據(jù)三者抑制特征以及患者身體情況，制定個性化的抗骨質(zhì)疏松癥治療方案。