王世浩 陳桐瑩 趙宇 劉樹華 萬雷

1．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405 2．廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510375

骨質(zhì)疏松癥的流行病學(xué)和發(fā)病機制研究顯示，除雌激素的缺乏外，衰老和相關(guān)的活性氧(reactive oxygen species , ROS)升高也是誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的重要原因[1]，有研究[2]證明低氧是保護骨骼免受ROS介導(dǎo)損害的關(guān)鍵因素，而骨骼和骨髓腔處于天然的低氧狀態(tài)[3]。低氧作為一種常見的特征性微環(huán)境，與生命活動息息相關(guān)，同時也與眾多疾病的發(fā)生和發(fā)展有著千絲萬縷的聯(lián)系，這些疾病包括心血管疾病、阻塞性肺炎、腫瘤、骨代謝、炎癥等。近年來研究表明，維持骨穩(wěn)態(tài)的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞均屬于氧感應(yīng)細(xì)胞[4]，低氧在參與調(diào)控骨重建和骨轉(zhuǎn)換的過程中發(fā)揮著重要作用[5]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，在缺氧環(huán)境下穩(wěn)定表達，具有相當(dāng)廣泛的靶基因譜，主要由120 kD的HIF-1α和91～94 kD的HIF-1β兩個亞單位組成[6]，其中HIF-1α是HIF-1的活性亞基，對氧氣十分敏感[7]，是重要的缺氧調(diào)控因子，有研究[8-9]證明HIF-1α對原發(fā)性和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的治療發(fā)揮著重要作用。故本文就HIF-1α在骨血管及骨代謝方面的作用對骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的影響及防治進行綜述。

1 HIF-1α的基本結(jié)構(gòu)與生物特性

HIF-1α和HIF-1β構(gòu)成HIF-1，其中HIF-1α的基因定位于人的14號染色體q21～24區(qū)，受缺氧信號調(diào)控；而HIF-1β的基因位于人的1號染色體q21區(qū)，又稱芳香烴受體核轉(zhuǎn)運子(ARNT)，起結(jié)構(gòu)性作用[10]。HIF-1α由氧依賴降解結(jié)構(gòu)域(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)和兩個反式激活結(jié)構(gòu)域(TAD-N和TAD-C)組成[11]，這些結(jié)構(gòu)域都是缺氧誘導(dǎo)蛋白穩(wěn)定、核定位和轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)域。

HIF-1α幾乎在所有類型的細(xì)胞中都有表達[12]，在常氧狀態(tài)下，HIF-1α上的脯氨酸殘基被脯氨酸羥化酶(PHD)羥基化[13]，這使得它可以被Von Hippel-Lindau蛋白(VHL)識別[14]，從而進行隨后的多泛素化和降解[15]。在低氧條件下，PHD的活性被抑制，阻止了HIF-1α的羥基化，導(dǎo)致HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)中積累并與HIF-1β結(jié)合形成二聚體，隨后被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在那里它與調(diào)節(jié)區(qū)的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合[16]，導(dǎo)致其下游靶基因的激活，進而誘導(dǎo)對缺氧的反應(yīng)，包括糖酵解、紅細(xì)胞生成、血管生成、細(xì)胞增殖和凋亡等過程。見圖1。

圖1 HIF-1α氧調(diào)控示意圖Fig.1 Schematic diagram of HIF-1α oxygen regulation

2 HIF-1α在骨血管及骨代謝方面對骨質(zhì)疏松癥的作用

2.1 HIF-1α調(diào)節(jié)骨血管作用

骨骼是有著豐富血管的組織，在骨發(fā)育過程中，骨組織的血管化具有非常重要的作用。除了已被廣泛認(rèn)知的骨膜表面血管外，Ritchlin等[17]首先在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種跨皮層血管，這種血管在人體內(nèi)同樣存在，說明在骨骼中有著比我們現(xiàn)有認(rèn)知更加龐大而精密的血管網(wǎng)絡(luò)。

骨血管是骨質(zhì)疏松癥研究中不可忽視的重要領(lǐng)域，豐富的骨血管是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞生長分化的關(guān)鍵，血液不僅提供養(yǎng)分，同時也提供骨形成所必需的氧，當(dāng)骨血管灌注不足時，骨組織就會形成低氧環(huán)境，從而誘導(dǎo)HIF-1α的穩(wěn)定表達，而HIF-1α可通過調(diào)節(jié)OASIS蛋白、miRNA-675-5p等影響骨血管形成。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激傳感器OASIS是一種堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉(zhuǎn)錄因子，它是CREB/ATF家族的成員，在骨形成中發(fā)揮著重要作用[18]，Cui等[19]在實驗中發(fā)現(xiàn)，OASIS-HIF-1α復(fù)合物可能在骨骼發(fā)育和血管生成中起重要作用。OASIS與HIF-1α的相互作用影響HIF-1α靶基因的表達，血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)在OASIS缺陷型小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的表達水平顯著降低，同時血管生成受阻。Costa等[20]研究發(fā)現(xiàn)常氧狀態(tài)下，HIF-1α被泛素化可調(diào)高miRNA-675-5p的表達，從而促進了MSC標(biāo)記(CD44、CD90和CD73)的下調(diào)，在低氧條件下HIF-1α的堆積會調(diào)低miRNA-675-5p的表達，進一步促進血管生成，以及恢復(fù)MSC的表型。HIF-1α可能通過miRNA-675-5P調(diào)節(jié)骨血管生成以及間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨的作用。

2.2 HIF-1α調(diào)節(jié)骨代謝

2.2.1HIF-1α調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞作用：成骨細(xì)胞可分泌骨膠原和骨基質(zhì)，是參與骨形成的主要功能細(xì)胞，低氧環(huán)境下，HIF-1α穩(wěn)定表達，ALP、Runx2、骨鈣蛋白等成骨標(biāo)志物顯著上調(diào)，表明成骨細(xì)胞增殖和分化作用增強。HIF-1α可通過對VEGF、IL-6、IL-8、Foxo1、VHL以及miRNA-497～195簇等的調(diào)控作用進而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生成。

低氧環(huán)境下，骨組織內(nèi)HIF-1α的表達增加，可上調(diào)VEGF，成骨細(xì)胞內(nèi)含VEGF受體(VEGFR-1、VEGFR-2等)，VEGF 與其受體結(jié)合，可增強成骨細(xì)胞移動和分化功能[21]，即HIF-1α可上調(diào)VEGF來增強成骨細(xì)胞的分化和活性。除了VEGF外，Niu等[22]發(fā)現(xiàn)缺氧條件下，隨著HIF-1α的上調(diào)，IL-6和IL-8的表達也被上調(diào)，表明低氧條件下HIF-1α的過表達顯著增加了成骨細(xì)胞中IL-6和IL-8的水平，而IL-6和IL-8可以顯著促進人成骨細(xì)胞的增殖。

Foxo1是Foxo家族中最早和最具代表性的成員之一，它在許多生理和病理過程中起著重要作用，包括增殖、凋亡、吞噬作用、新陳代謝、炎癥、分化和氧化應(yīng)激，F(xiàn)oxo1還是成骨細(xì)胞增殖和維持人體氧化還原平衡所需的轉(zhuǎn)錄因子。Xu[23]使用從兒童松質(zhì)骨獲得的成骨細(xì)胞，在敲低HIF-1α后，明顯增加了細(xì)胞中的活性氧水平和凋亡，而HIF-1α的過表達刺激了細(xì)胞活力，也增加了Foxo1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，沉默HIF-1α?xí)黠@抑制細(xì)胞活力及Foxo1的表達水平。此外，沉默HIF-1α?xí)档统晒菢?biāo)志物(包括Runx2、ALP和骨鈣蛋白)的表達，而Foxo1(siRNA)明顯逆轉(zhuǎn)了HIF1α誘導(dǎo)的Runx2和ALP表達，但Foxo1(siRNA)對骨鈣素的影響不明顯。因此HIF-1α和Foxo1的相互作用參與了成骨細(xì)胞標(biāo)志物的調(diào)控，并在成骨細(xì)胞的增殖和凋亡中起關(guān)鍵作用。

Shao等[24]通過條件性刪除von Hippel-Lindau(VHL)基因，HIF-1α在成熟成骨細(xì)胞中的過表達將顯著增加血管生成和成骨作用，成骨細(xì)胞缺乏VHL的小鼠具有高水平的HIF-1α，并增加了骨質(zhì)量和密度。而HIF-1α條件性基因敲除小鼠的骨量和骨密度降低，研究還表明破骨細(xì)胞活性的必要調(diào)節(jié)劑骨保護素(OPG)可以被HIF-1α上調(diào)，進而下調(diào)破骨細(xì)胞的吸收活性，因此HIF-1α可能直接結(jié)合到OPG的上游位點并增強其表達，進而干擾成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的骨耦合。

miRNA是一種非編碼小分子RNA，是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，HIF-1α也可通過miRNA進而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞作用。Yang等[25]發(fā)現(xiàn)miRNA-497～195簇的過表達會上調(diào)HIF-1α水平，而miRNA-497～195簇在CD31hiEmcnhi內(nèi)皮細(xì)胞中高表達，CD31和內(nèi)粘蛋白(CD31hiEmcnhi)為血管生成與成骨的耦合的特定骨血管亞型，對骨形成有重要作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中敲低了miRNA-497～195的小鼠顯示出較少的CD31hiEmcnhi血管和較低的骨量，而miRNA-497～195在小鼠基因中的過表達則會逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。

2.2.2HIF-1α調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞作用：現(xiàn)有研究已證實在破骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中腫瘤壞死因子受體家族的 NF-κB 受體活化因子配體(RANKL) 和骨保護素(OPG)起著重要的作用。RANKL與破骨細(xì)胞的核因子κB受體活化因子( receptor activator of NF-κB，RANK) 結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，刺激破骨細(xì)胞分化增殖，使骨吸收增加，骨量丟失；OPG可與RANKL結(jié)合，競爭性阻斷RANKL與RANK 的結(jié)合，從而抑制前體破骨細(xì)胞的分化和融合，抑制成熟破骨細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)其凋亡[26]。

HIF-1α可通過OPG / RANK / RANKL、JAK2 / STAT3等多種信號通路直接或者間接產(chǎn)生對破骨細(xì)胞分化和吸收活性作用，但是其具體影響因素和機制還有待明確。破骨細(xì)胞作為防治骨質(zhì)疏松癥的重要切入點，HIF-1α對破骨細(xì)胞作用的研究是具有重要意義的。

Shao等[24]發(fā)現(xiàn)HIF-1α可通過上調(diào)破骨細(xì)胞活性的必要調(diào)節(jié)劑骨保護素(OPG)，進而抑制破骨細(xì)胞活性。Shi等[27]研究同樣發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下，HIF-1α的可增加hMSCs中OPG的表達增加，并降低RANKL表達，增加OPG / RANKL比，顯著促進成骨分化。而Kang等[28]發(fā)現(xiàn)HIF-1α除了上調(diào)OPG，還可以刺激白介素33(IL-33)表達增加，從而抑制破骨細(xì)胞生成。HIF-1α通過結(jié)合IL-33上的-1 504/-1 500 bp促進IL-33表達啟動子，IL-33作用于骨髓來源的單核細(xì)胞(BMM)，以減少其破骨細(xì)胞分化。但是Zhu等[29]的研究表明在缺氧條件下，上調(diào)的HIF-1α促進了RANKL的形成，從而促進破骨細(xì)胞的形成，RANKL的表達隨缺氧持續(xù)時間先升高后降低，該表達在24 h達到峰值。這與Knowles等[30]的觀點一致，其證實破骨細(xì)胞在低氧分化過程中需要復(fù)氧，如果持續(xù)暴露在缺氧下，由于細(xì)胞的廣泛死亡，會明顯抑制破骨細(xì)胞的形成和骨吸收功能。缺氧下HIF-1α的穩(wěn)定表達可通過上調(diào)RANKL來促進破骨細(xì)胞的形成，其結(jié)論與Shi等[27]實驗結(jié)論相悖，可見HIF-1α調(diào)控破骨細(xì)胞的具體機制以及影響因素還有待進一步研究。

Zhu等[31]在另一個研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α通過激活MLO-Y4細(xì)胞中的JAK2 / STAT3通路來促進RANKL的表達，從而影響破骨細(xì)胞的生成。在缺氧條件下，JAK2抑制劑AG490抑制了p-JAK2、p-STAT3和RANKL表達，即AG490可能通過JAK2 / STAT3通路干擾了HIF-1α對RANKL的調(diào)節(jié)，從而影響破骨細(xì)胞的生成。Hulley等[32]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α siRNA僅適度影響破骨細(xì)胞的分化，通過抑制PHD誘導(dǎo)HIF-1α表達來減少破骨細(xì)胞生成，實際上是通過增強成熟破骨細(xì)胞的骨吸收來實現(xiàn)的，HIF-1α可能主要調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，對破骨細(xì)胞分化幾乎沒有影響。

2.2.3HIF-1α調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞作用：間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是屬于中胚層的一類多能干細(xì)胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，具有強大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下具有分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。

HIF-1α可通過調(diào)節(jié)miRNA-675-5P、VEGF、SDF-1的表達，直接或間接調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移以及向成骨分化作用，繼續(xù)深入研究HIF-1α對間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)作用對骨質(zhì)疏松癥的防治有著不可忽略的價值。

Costa等[20]發(fā)現(xiàn)HIF-1α可通過miRNA-675-5P調(diào)節(jié)人間充質(zhì)干細(xì)胞向血管成骨的作用，在低氧條件下HIF-1α的堆積會調(diào)低miRNA-675-5p的表達，進一步促進血管生成及MSCs的增殖。Yu等[33]研究了CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞缺氧對MSCs成骨分化的影響，低氧增強了MSCs中HIF-1α的表達和STAT3的磷酸化，促進了成骨分化和VEGF表達，證明HIF-1α可通過STAT3信號促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨缺損愈合。Xu等[34]研究證明缺氧條件下HIF-1α的表達增加了MSC的趨化性遷移，在缺氧(1 %氧氣)條件下培養(yǎng)4～6 h后，遷移的MSCs數(shù)量明顯增加，同時，缺氧也增加了HIF-1α和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)的表達, SDF-1及其受體CXCR4能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移；敲低MSCs中HIF-1α的表達，不僅消除了MSCs的遷移，而且也減少了SDF-1的表達。Lee等[35]發(fā)現(xiàn)HIF-1α促進78 kDa葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)的表達，通過HIF-1α-GRP78-Akt信號通路促進了MSCs的增殖和遷移潛能。

3 HIF-1α在治療骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用

目前HIF-1α在治療骨質(zhì)疏松癥方面的應(yīng)用多停留在細(xì)胞和動物模型實驗上，無論是單體還是中藥復(fù)方，均可通過作用于HIF-1α來對骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生很好的治療效果。紅景天苷(SAL)是玫瑰紅景天的主要活性成分，具有多種藥理作用，Li等[36]在研究中發(fā)現(xiàn)SAL在體外和體內(nèi)均顯示出抗缺氧作用，在低氧環(huán)境中，SAL通過刺激細(xì)胞活力，分化和礦化作用以及上調(diào)Osterix和Runx2表達來增強成骨作用，而這些作用歸因于HIF-1α信號通路的激活，SAL通過HIF-1α信號通路來保護MG63和ROB細(xì)胞免受CoCl2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷和功能障礙。此外，研究還顯示SAL改善了OVX引起的骨質(zhì)疏松癥，在OVX大鼠模型中，由VEGF表達增加引起的血管新生顯著修復(fù)了OVX大鼠的骨骼，防止骨質(zhì)流失和骨小梁微結(jié)構(gòu)改變。Guo等[37]發(fā)現(xiàn)，SAL可通過MAPK / ERK和PI3K / Akt信號通路影響HIF-1αmRNA表達，SAL可增強HIF-1α靶基因轉(zhuǎn)錄活性來上調(diào)VEGF，并通過促進成骨細(xì)胞的增殖，分化，礦化來增強成骨作用，SAL也增加了血管生成和加速小鼠模型的骨折愈合。Yuan等[38]研究表明補腎通絡(luò)湯(BSTLD)在OVX大鼠動物模型中，穩(wěn)定了HIF-1α活性，隨后增加了VEGF表達，并增強了血管生成和調(diào)節(jié)RANKL / OPG信號傳導(dǎo)，保護卵巢切除引起的骨質(zhì)疏松大鼠的小梁骨密度和小梁骨微結(jié)構(gòu)。

4 展望

現(xiàn)階段對骨質(zhì)疏松癥的認(rèn)識已趨于成熟，其治療方法也不斷推陳出新，但是我們用于防治骨質(zhì)疏松癥的方法還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。氧是骨細(xì)胞生長、發(fā)育及功能代謝的重要條件，氧感應(yīng)細(xì)胞包括成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖分化以及骨血管在骨質(zhì)疏松的形成、發(fā)展及防治中發(fā)揮著重要的作用。隨著細(xì)胞感知和適應(yīng)氧氣的機制被揭開，HIF-1α可能成為骨質(zhì)疏松癥極具潛力的新靶點。但是目前HIF-1α對骨血管生成、骨代謝的作用仍缺乏深入研究，明確其作用機制，尤其是對破骨細(xì)胞作用機制成為目前亟待解決的問題。