高二夢(mèng)，千日成

眾所周知，人體的卵泡發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，以原始卵泡為起點(diǎn)，經(jīng)歷了初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、三級(jí)卵泡，最終發(fā)育為成熟卵泡。顆粒細(xì)胞（granulosa cell，GC）是卵母細(xì)胞周?chē)捏w細(xì)胞，與卵母細(xì)胞共處于同一卵泡微環(huán)境[1]。伴隨著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，卵母細(xì)胞周?chē)腉C同樣經(jīng)歷一系列的變化，從最初的單層扁平的前顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)層柱狀細(xì)胞，至竇前卵泡最終發(fā)育成為竇卵泡，卵泡周?chē)鶪C數(shù)目明顯增多，GC內(nèi)開(kāi)始合成并分泌出黏多糖蛋白形成早期的竇腔[2]，至此，GC分化為在空間和功能上不同的2個(gè)種群——卵丘細(xì)胞（cumulus cell，CC）和壁顆粒細(xì)胞（mural granulosa cell，MGC）[3]。

許多學(xué)者認(rèn)為CC與MGC是起源一致、位置不同的同一種細(xì)胞，然而從既往發(fā)表的文獻(xiàn)可以看出，已有關(guān)于CC和MGC在功能、基因和細(xì)胞譜系等方面的研究，這些研究提示CC與MGC不僅存在著解剖學(xué)上的差異，同樣存在著功能、基因等方面的差異。而到目前為止，人CC和MGC在代謝方面的差異尚少見(jiàn)報(bào)道。學(xué)者們認(rèn)為，CC與MGC之間同樣存在著代謝譜的差異。探究CC與MGC之間的差異可能有助于評(píng)估卵子質(zhì)量、提高胚胎質(zhì)量以及改善妊娠結(jié)局，具有重要的臨床價(jià)值。

1 CC與MGC在概念和發(fā)育過(guò)程中的差異

卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育受卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）、類(lèi)固醇激素以及卵巢和卵母細(xì)胞來(lái)源的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子等共同調(diào)節(jié)。GC的增殖對(duì)卵泡生長(zhǎng)至關(guān)重要，而GC誘導(dǎo)的黃體化則終止排卵前卵泡的生長(zhǎng)[4]。

在卵巢中，GC是為卵母細(xì)胞生長(zhǎng)提供物理支持和微環(huán)境的原發(fā)細(xì)胞類(lèi)型，當(dāng)卵母細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)發(fā)育后期，卵泡形成竇腔。從次級(jí)卵泡的發(fā)育直至形成卵泡竇腔，GC開(kāi)始分化為MGC和CC[1]。CC圍繞在卵母細(xì)胞周?chē)?，與卵母細(xì)胞直接接觸形成卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（cumulus-oocyte complex，COC），其數(shù)量與卵母細(xì)胞密切相關(guān)。人類(lèi)卵母細(xì)胞周?chē)腃C數(shù)量一直被認(rèn)為是植入潛力的標(biāo)志。而MGC則分布在卵泡壁上，與卵泡壁相關(guān)，主要承擔(dān)類(lèi)固醇生成功能[5]。CC的分化由卵母細(xì)胞分泌有效的生長(zhǎng)因子（oocytes secrete effective growth factor，OSF）介導(dǎo)，而MGC的形成則受卵泡外、垂體前葉分泌的FSH調(diào)控，見(jiàn)圖1。MGC中LH受體（LH receptor，LHR）的mRNA表達(dá)是GC分化的一個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志物，與MGC相比，人CC表達(dá)的LHR水平顯著降低，但保留了CYP19A1和FSH受體（FSH receptor，F(xiàn)SHR）的表達(dá)[6]。卵母細(xì)胞通過(guò)分泌不穩(wěn)定的旁分泌信號(hào)因子抑制GC向MGC分化，但促進(jìn)GC向CC分化，以此來(lái)調(diào)節(jié)控制其發(fā)育微環(huán)境[7]。

圖1 GC分化示意圖

1.1 CC的概念及發(fā)生發(fā)展CC是卵母細(xì)胞的支持細(xì)胞，在卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟、排卵和受精過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。放射冠被認(rèn)為是卵母細(xì)胞周?chē)牡谝粚覥C，CC在靠近卵母細(xì)胞的內(nèi)層比外層更加緊湊，呈向心性膨脹[9]。CC直接接觸卵母細(xì)胞，胞質(zhì)突起穿越透明帶，與卵母細(xì)胞建立縫隙連接，形成COC[1]，該復(fù)合物直接影響基因表達(dá)和蛋白合成，通過(guò)縫隙連接、連接蛋白和旁分泌信號(hào)的雙向通信調(diào)控卵母細(xì)胞發(fā)育，實(shí)現(xiàn)卵丘和卵母細(xì)胞間的溝通，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的分化、擴(kuò)張和成熟等?？p隙連接由細(xì)胞膜間通道蛋白聚合體構(gòu)成，連接蛋白Cx43和Cx37是與之最密切相關(guān)的2個(gè)蛋白，該通道允許離子、小分子和小代謝物通過(guò)，但不允許蛋白質(zhì)、核酸等大分子通過(guò)。縫隙連接幫助CC為卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育提供能量和營(yíng)養(yǎng)，至發(fā)育晚期，縫隙連接通過(guò)調(diào)節(jié)通道的減少或關(guān)閉促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟[1，10]。

1.2 MGC的概念及發(fā)生發(fā)展MGC排列在卵泡內(nèi)壁上，與卵泡生長(zhǎng)、分化、成熟以及后續(xù)的排卵和維持妊娠密切相關(guān)，主要執(zhí)行內(nèi)分泌功能，其通過(guò)分泌蛋白酶促進(jìn)排卵，排卵后MGC會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生孕酮的黃體細(xì)胞，參與隨后的一系列激素調(diào)節(jié)過(guò)程。在LH的作用下，MGC和卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞分裂增生，細(xì)胞成多邊形，胞質(zhì)內(nèi)有黃色顆粒和脂滴，呈黃色，稱(chēng)為黃體。顆粒黃體細(xì)胞（granulosa lutein cell）由卵泡GC轉(zhuǎn)變而成，位于黃體中央，細(xì)胞大，染色淡，主要分泌孕酮。卵泡膜黃體細(xì)胞（theca lutein cell）位于黃體周邊，表面不平坦，細(xì)胞小，染色深，主要合成雌激素。而CC則不像MGC那樣黃體化[11]。CC與MGC的相關(guān)差異見(jiàn)圖2。

圖2 CC和MGC的相關(guān)差異

2 CC與MGC在功能上的差異

2.1 CC的基本功能眾所周知，卵母細(xì)胞本身不能合成膽固醇，無(wú)法吸取葡萄糖代謝。初級(jí)卵泡時(shí)期，單層柱狀的GC為卵母細(xì)胞提供約85%的營(yíng)養(yǎng)，至竇卵泡期，來(lái)源于未分化GC的CC分解膽固醇和葡萄糖，通過(guò)縫隙連接為卵母細(xì)胞提供必需的氨基酸和核苷酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同樣的，卵母細(xì)胞也通過(guò)縫隙連接傳遞其分泌的信號(hào)分子，調(diào)控CC的增殖和膨脹，這是一種雙向的“對(duì)話(huà)”機(jī)制。在卵泡發(fā)育至竇卵泡后期，CC上大量FSHR合成，產(chǎn)生更多的雌激素，促使卵泡發(fā)育，優(yōu)勢(shì)卵泡形成，優(yōu)勢(shì)卵泡相較于其他群體對(duì)FSH更敏感，并產(chǎn)生較高水平的雌激素和調(diào)節(jié)激素抑制素[12]。卵母細(xì)胞在黃體中期LH峰的刺激下完成第一次減數(shù)分裂，并停滯于第二次減數(shù)分裂中期（Metaphase Ⅱ，MⅡ期），而CC與卵母細(xì)胞之間的物質(zhì)交換很可能是維持減數(shù)分裂停滯狀態(tài)的重要因素。

通過(guò)縫隙連接，CC 將環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞，參與抑制卵母細(xì)胞成熟。排卵前LH激增，CC與卵母細(xì)胞的溝通通道減少甚至關(guān)閉，受CC調(diào)控的cAMP進(jìn)入卵母細(xì)胞減少，卵母細(xì)胞中抑制物cAMP水平下降，減數(shù)分裂恢復(fù)，卵母細(xì)胞成熟[13]。

在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，CC表達(dá)透明質(zhì)酸合成酶2（hyaluronate synthase 2，HAS2），分泌富含透明質(zhì)酸的基質(zhì)。這種具有黏液彈性的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在CC之間積聚，使得CC彼此相互分離擴(kuò)散，稱(chēng)為卵丘擴(kuò)張，這是卵母細(xì)胞成熟和排卵的關(guān)鍵步驟。擴(kuò)張能力是CC分化的一個(gè)獨(dú)特特征，MGC并不具備[5]。

CC合成透明質(zhì)酸是由FSH誘導(dǎo)的，其機(jī)制可能與卵母細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性因子密切相關(guān)。卵母細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子通過(guò)CC呈放射狀擴(kuò)散，建立了一個(gè)濃度梯度[14]。Nagyova等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CC及接近COC的MGC中都有透明質(zhì)酸的合成，而外周MGC的最外層很少或沒(méi)有檢測(cè)到透明質(zhì)酸的活性，但造成這種差異的原因尚存在爭(zhēng)議。

2.2 MGC的基本功能CC的功能主要是為卵母細(xì)胞服務(wù)的，而MGC主要合成類(lèi)固醇激素，并分泌FSHR和LHR等激素受體，其既是甾體激素的產(chǎn)生部位，也是促性腺激素的作用部位。類(lèi)固醇激素生物合成的第一步和限速步驟發(fā)生在GC的線(xiàn)粒體中，而甾體生成過(guò)程主要為膽固醇通過(guò)各種甾體激素中間體轉(zhuǎn)化為孕酮、雄激素和雌二醇等[12]。MGC與卵母細(xì)胞之間被CC和充滿(mǎn)卵泡液的竇腔分開(kāi)，其某些表型的表達(dá)不足使其難以支撐卵母細(xì)胞的發(fā)育，但可產(chǎn)生甾體激素和生長(zhǎng)因子并分泌到濾泡液中，對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育及排卵發(fā)揮重要作用[15]。

FSH可刺激GC將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，低水平的LH可維持卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，而排卵則需要高水平的LH。FSH和LH的激增啟動(dòng)排卵，卵泡的一系列激活導(dǎo)致MGC表皮生長(zhǎng)因子的分泌，從而進(jìn)一步促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)、卵丘擴(kuò)張、類(lèi)固醇生成和黃體化等，這些對(duì)受精、胚胎發(fā)育和成功植入十分重要[16]。CC同樣也可以分泌許多細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，這些可能在為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)中發(fā)揮重要作用，其和MGC對(duì)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的作用是一種重疊控制和相互依存的關(guān)系[17]。

排卵需要內(nèi)分泌和旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及MGC（LHR+）和卵丘GC（LHR-）之間的相互作用，LH效應(yīng)主要是針對(duì)MGC而不是CC，在人卵泡中，LHR/絨毛膜促性腺激素受體（chorionic gonadotropin receptor，CGR）主要在卵泡膜和MGC中表達(dá)，在CC中表達(dá)較低，在卵母細(xì)胞中則不表達(dá)[18]。因此，LH激增直接影響MGC，首先MGC對(duì)LH反應(yīng)產(chǎn)生生長(zhǎng)因子，并通過(guò)旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)和縫隙連接間接影響卵母細(xì)胞和CC，由CC通過(guò)自分泌強(qiáng)化[19]。

排卵前LH 的激增導(dǎo)致MGC 內(nèi)cAMP 濃度的急劇上升，隨后，在cAMP 的誘導(dǎo)下，雙調(diào)蛋白（amphiregulin,AREG）、表皮調(diào)節(jié)素（epiregulin）和β-細(xì)胞素（betacellulin）等表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）樣肽短暫表達(dá)，它們是卵丘擴(kuò)張、卵母細(xì)胞成熟和排卵的關(guān)鍵旁分泌介質(zhì)[13]。至卵泡發(fā)育后期，在LH作用下優(yōu)勢(shì)卵泡的黃體酮分泌增加，黃體酮是子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備和維持妊娠所必需的[19]。排卵前的LH含量也會(huì)決定卵泡內(nèi)類(lèi)固醇的產(chǎn)量，從而影響妊娠周期中的胚胎植入能力[20]。CC和MGC的功能關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3 CC與MGC功能關(guān)系圖

3 CC與MGC在轉(zhuǎn)錄本與細(xì)胞譜系上的差異

現(xiàn)有研究已經(jīng)提示了CC與MGC存在著轉(zhuǎn)錄譜上的差異，與代謝和細(xì)胞增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在CC中富集，而與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在MGC中富集[21]。Wigglesworth等[22]對(duì)MGC及CC的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CYP19A1、CYP11A1、Star、Twsg1、Nppc、Nrip1、Tob1、LHR和Grem1在MGC中的表達(dá)高于在CC中的表達(dá)，而Npr2、Ldha、Mvk、Eno1、Fdps、Slc38a3、Pfkp、Nog、Tpi1和Smad7則在CC中的表達(dá)更高。此外，Gr?ndahl等[23]在對(duì)排卵前CC和MGC相似性、差異性和相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，1 562個(gè)基因在CC和MGC中有2倍差異表達(dá)，1 406個(gè)基因有2～8倍差異性表達(dá)，156個(gè)基因有8倍差異表達(dá)。與MGC相比，CX40在CC中的表達(dá)比在MGC中高出16倍以上，CX43在CC中的表達(dá)略高（約是MGC中的1.6倍），CC和MGC的表達(dá)譜清楚地顯示其是具有分化功能的2個(gè)細(xì)胞群體。

3.1 CC的轉(zhuǎn)錄譜系特點(diǎn)與CC相比，MGC中LHR高表達(dá)，甾體生成能力強(qiáng)，MGC具有獨(dú)特的表觀遺傳特征，存在更多的年齡相關(guān)的甲基化差異區(qū)域（differential methylation regions，DMR），而且MGC表達(dá)的胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placenta growth factor，PLGF）是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物排卵、卵泡血管生成和黃體化所必需的。由此可見(jiàn)，MGC在卵泡形成和與卵母細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[24]。LHR基因編碼一種糖蛋白受體，屬于G蛋白耦聯(lián)受體，LH與LHR結(jié)合激活相應(yīng)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平增高和前列腺素合成增加[25]。LHR受體在膜細(xì)胞和MGC中的高表達(dá)，對(duì)產(chǎn)生雄烯二酮、睪酮和孕酮以及排卵、卵泡成熟、黃體化和黃體形成十分必要，優(yōu)勢(shì)卵泡的GC最終獲得LHR，這是排卵前卵泡的標(biāo)志[12]。LH激增導(dǎo)致排卵、黃體化，并導(dǎo)致形成黃體LHR的蛋白和mRNA水平下調(diào)[26]。

3.2 MGC的轉(zhuǎn)錄譜系特點(diǎn)與MGC相比，CC具有高抗苗勒管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）表達(dá)、高增殖率、低LHR表達(dá)、低甾體生成能力的特點(diǎn)。在CC中，重組蛋白gremlin（GREM）、HAS2和環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）等高表達(dá)可作為優(yōu)質(zhì)胚胎的指標(biāo)。一些基因的表達(dá)，例如PTX3，可作為評(píng)估卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量的生物標(biāo)志物[7，27]。一些特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，如AMH和Slc38a3等在CC中的表達(dá)水平高于MGC[22]。AMH是一種糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，通過(guò)AMH受體Ⅱ發(fā)揮生物學(xué)功能，其比FSH、雌二醇、抑制素B和竇卵泡計(jì)數(shù)（antral follicle count，AFC）更早反映卵巢儲(chǔ)備隨年齡增加而下降的趨勢(shì)。同時(shí)，AMH基因是FOXO1/3和激活素的潛在靶點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子家族成員FOXO在特定的卵巢細(xì)胞中高度表達(dá)，被認(rèn)為是卵泡生長(zhǎng)和（或）凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[4]。而晚期竇卵泡的CC表達(dá)的Slc38a3與卵母細(xì)胞的成熟有關(guān)，其可編碼中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（neutral amino acid transporter），負(fù)責(zé)CC與卵母細(xì)胞間的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)，而在GC中則沒(méi)有或很少有Slc38a3的表達(dá)。

4 結(jié)語(yǔ)

在竇卵泡期，CC由OSF介導(dǎo)形成，圍繞在卵母細(xì)胞周?chē)瑸槁涯讣?xì)胞提供必需的氨基酸和核苷酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。MGC在FSH趨化下排列在卵泡壁周?chē)?，?zhí)行著類(lèi)固醇生成等功能。而在基因表達(dá)上，既往研究表明，與代謝和細(xì)胞增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在CC中富集，而與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在MGC中富集?？傊?，CC與MGC并非學(xué)者們固有認(rèn)知里的位置不同的同一種細(xì)胞，兩者存在著多方面的差異性，而且CC和MGC在代謝組學(xué)上可能同樣存在差異性，但這一點(diǎn)尚無(wú)任何報(bào)道。卵泡微環(huán)境中的代謝改變尤其是脂質(zhì)代謝對(duì)維持正常的生殖功能至關(guān)重要，脂質(zhì)代謝通過(guò)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖、凋亡、能量代謝和類(lèi)固醇激素合成對(duì)卵泡成熟具有重要作用[28]。研究表明，剝?nèi)ブ車(chē)鶦C的卵母細(xì)胞具有低糖酵解活性。Purcell等[29]發(fā)現(xiàn)，胰島素受體和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)所需的許多成分同時(shí)存在于CC和卵母細(xì)胞中，胰島素刺激的葡萄糖攝取發(fā)生在小鼠的致密和膨脹的CC中，也發(fā)生在人類(lèi)的CC中，而卵母細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)胰島素刺激的葡萄糖攝取的發(fā)生。CC和MGC在功能和基因表達(dá)上存在差異，包括參與糖代謝通路、脂質(zhì)代謝通路和類(lèi)固醇代謝通路的基因差異，由此推測(cè)，CC和MGC在發(fā)育的不同階段同樣存在著代謝組學(xué)上的差異。GC中富集大量的代謝產(chǎn)物[28]，但兩者之間在代謝譜表達(dá)上的差異性尚有待進(jìn)一步的研究。探索兩者之間的差異可能為學(xué)者們開(kāi)發(fā)評(píng)估卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量新的標(biāo)志物提供新思路，這對(duì)改善妊娠結(jié)局具有重要的臨床意義。