朱 瑩，孔江波，孫潘婷，孫彥君,2，馮衛(wèi)生,2，李玉賢,2*，陳 輝,2*

1河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450046

海風(fēng)藤為胡椒科Piperaceae胡椒屬植物風(fēng)藤Piperkadsura(Choisy) Ohwi的干燥藤莖，主產(chǎn)于我國臺(tái)灣、云南、廣東等地。海風(fēng)藤味辛、苦，性微溫，歸肝經(jīng)，具有“祛風(fēng)濕，通經(jīng)絡(luò)，止痹痛”等功效，臨床上用于治療風(fēng)寒濕痹，肢節(jié)疼痛等癥[1,2]。藥理研究表明海風(fēng)藤在治療阿爾茲海默癥，抗炎，鎮(zhèn)痛和器官缺血再灌注等方面具有顯著的藥用價(jià)值[3-7]?；瘜W(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)海風(fēng)藤中主要含有新木脂素類、生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油等成分[8,9]，其中酰胺生物堿類成分是該屬植物中的特征成分，且含量較大，在海風(fēng)藤中亦有報(bào)道。目前國內(nèi)外學(xué)者對海風(fēng)藤的研究主要集中于其中的新木脂素類及其在治療和預(yù)防阿爾茲海默癥、缺血性腦血管病等方面[3-7]，但對于該植物中的酰胺生物堿類化合物報(bào)道較少。帕金森病(PD)是僅次于阿爾茲海默癥第二常見的神經(jīng)退行性疾病，近年來研究發(fā)現(xiàn)含有海風(fēng)藤的一些中藥復(fù)方或制劑對于PD具有較好的改善作用[10-12]，但缺少相應(yīng)的化學(xué)成分研究基礎(chǔ)?；谝陨蠁栴}，我們開展了海風(fēng)藤中酰胺生物堿類成分的研究，并采用MPP+致?lián)p傷PC12細(xì)胞構(gòu)建PD細(xì)胞模型，對分離得到的化合物進(jìn)行體外神經(jīng)保活性篩選，為后續(xù)該植物活性成分的開發(fā)和利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker AVANCE III 500 MHz型核磁共振儀(德國Bruker公司)；Bruker maxis HD 型飛行時(shí)間質(zhì)譜(德國Bruker公司)；N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；SHB-B 95A型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DFZ-3型真空干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；賽譜銳思LC 52型高壓制備液相色譜儀(賽譜銳思北京科技有限公司，SP 5030型半制備型高壓輸液泵，UV 200型紫外檢測器，Easychrom型色譜工作站；色譜柱為YMC-Pack ODS-A，250 mm × 20 mm，5 μm)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech公司)；ODS(40～60 μm YMC)；甲醇，色譜純(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；其他試劑均為分析級；薄層層析硅膠選用10～40 μm的粒徑，以0.5% CMC-Na制板，陰干，105 ℃活化0.5 h；MPP+(Sigma)，MTS(Promega)。

海風(fēng)藤于2018年6月采購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為胡椒科胡椒屬植物風(fēng)藤Piperkadsura(Choisy) Ohwi的干燥藤莖，標(biāo)本存放于河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)研究室(標(biāo)本號ID-20180609I)。

1.2 提取與分離

海風(fēng)藤藥材粗粉(40 kg)，采用二氯甲烷冷浸提取，每次24 h，共提取3次，繼續(xù)用甲醇冷浸提取；提取液經(jīng)減壓濃縮，得到二氯甲烷部位浸膏600 g，甲醇部位浸膏450 g。將二氯甲烷部位總浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮系統(tǒng)(100∶0→0∶100)梯度洗脫，共分離得到13個(gè)流分(Fr.1～13)。流分Fr.7經(jīng)中壓柱色譜分離，依次用甲醇-水(30%→100%甲醇)梯度洗脫，得6個(gè)亞流分(Fr.7-1～Fr.7-6)。將Fr.7-3經(jīng)半制備型HPLC制備(甲醇-水70%)制備得化合物9(20 mg，tR= 28 min)，將Fr.7-5經(jīng)硅膠柱色譜分離(石油醚：丙酮)，再經(jīng)半制備型HPLC制備得化合物8(2.6 mg，tR= 22 min)。流分Fr.8經(jīng)中壓柱色譜分離，依次用甲醇-水(30%→100%甲醇)梯度洗脫，得7個(gè)亞流分(Fr.8-1～Fr.8-7)。將Fr.8-3經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮(100∶0→0∶100)梯度洗脫，再結(jié)合制備型HPLC制備(甲醇-水 60%)得化合物1(5 mg，tR= 40 min)、2(6 mg，tR= 66 min)、3(14 mg，tR= 60 min)、4(10 mg，tR= 80 min)、6(8 mg，tR= 120min)。將Fr.8-4經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮(100∶0→0∶100)梯度洗脫，再結(jié)合制備型HPLC制備(甲醇-水 70%)得化合物7(2.5 mg，tR= 68 min)、11(1.5 mg，tR= 57 min)。將Fr.8-6經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮(100∶0→0∶100)梯度洗脫，再結(jié)合半制備型HPLC制備(甲醇-水 90%)得化合物5(2.6 mg，tR= 26 min)、10(3 mg，tR= 25 min)。將甲醇部位總浸膏進(jìn)行硅藻土柱色譜分離，得石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及甲醇4部位樣品。將乙酸乙酯部位總浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮系統(tǒng)(50∶1→0∶100)梯度洗脫，共分離得到8個(gè)流分(Fr.E1～E8)。將組分Fr.E3經(jīng)凝膠柱色譜分離，再結(jié)合制備型HPLC制備(甲醇-水 75%)得化合物12(5.5 mg，tR= 68 min)、13(3.5 mg，tR= 57 min)。

1.3 體外神經(jīng)保護(hù)活性測試

PC12低分化細(xì)胞置于10%FBS及100 U/mL的DMEM高糖雙抗的培養(yǎng)基中，并在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至合適數(shù)量，用胰酶消化制成細(xì)胞懸液吸至15 mL離心管中，800 rpm，離心5 min后棄上清，加入新的完全培養(yǎng)基5 mL，用移液器吹打10次，盡量吹散細(xì)胞，取0.02 mL細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×105個(gè)/ mL接種到96孔板繼續(xù)培養(yǎng)。23 h后，吸出培養(yǎng)基，根據(jù)加入成分不同分成3組，每組平行重復(fù)3次[13]?？瞻讓φ战M：只加入新培養(yǎng)基；模型組：加入培養(yǎng)基及終濃度750 μM MPP+，24 h后，加入MTS，2 h后，讀值檢測；藥物組：加入培養(yǎng)基及終濃度20 μM化合物，再加終濃度750 μM MPP+，24 h后，加入MTS，2 h后，讀值檢測。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色針狀結(jié)晶(CHCl3)；mp.133.2 ℃；UV光譜中顯示該化合物在甲醇溶液中的最大吸收為276 nm；IR光譜顯示有胺基(3 315 cm-1)和共軛羰基(1 648 cm-1)等特征吸收峰；HR-ESI-MS：m/z238.180 9 [M + H]+(計(jì)算值為238.180 2)，確定化合物1的分子式為C14H23NO2，計(jì)算不飽和度為4。1H NMR譜中(表1)，低場區(qū)顯示有2組烯烴質(zhì)子信號δH6.26(1H，d，J= 14.6 Hz，H-2)，7.29(1H，dd，J= 14.6，11.6 Hz，H-3)和7.20(1H，dd，J= 15.1，11.6 Hz，H-4)，6.46(1H，d，J= 15.1 Hz，H-5)，根據(jù)其偶合常數(shù)推測分子中存在2個(gè)反式雙鍵。此外，δH5.84處的質(zhì)子信號，結(jié)合HSQC譜，推測為胺基活潑質(zhì)子信號。高場區(qū)δH3.21～1.36之間出現(xiàn)4個(gè)亞甲基質(zhì)子信號δH3.21(2H，t，J= 6.3 Hz，H-1′)，2.59(2H，t，J= 7.3 Hz，H-7)，1.63(2H，m，H-8)，1.36(2H，m，H-9)和1個(gè)次甲基質(zhì)子信號δH1.84(1H，m，H-2′)。此外，高場區(qū)還顯示3個(gè)甲基質(zhì)子信號δH0.94(6H，d，J= 6.2 Hz，H-3′，4′)，0.92(3H，t，J= 7.3 Hz，H-10)。13C NMR譜中共顯示14個(gè)碳信號，進(jìn)一步結(jié)合DEPT和HSQC譜確定化合物1顯示有2個(gè)羰基碳信號δc200.3(C-6)、165.1(C-1)，4個(gè)雙鍵碳信號，4個(gè)亞甲基碳信號，1個(gè)次甲基碳信號以及3個(gè)甲基碳信號。綜合以上光譜數(shù)據(jù)信息，推測化合物1為酰胺類生物堿(見圖1)。

圖1 化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-13

1H-1H COSY譜中(圖2)H-3與H-4有相關(guān)，說明分子中的2個(gè)反式雙鍵以1，3共軛的形式存在；H-7與H-8、H-8與H-9、H-9與H-10存在相關(guān)，證明該化合物存在1個(gè)正丁基片段；H-1′與H-2′、-NH-，H-2′與H-3′、4′存在相關(guān)，證明該化合物有異丁基片段，且與氨基相連形成-NH-CH2-CH-(CH3)2結(jié)構(gòu)片段。HMBC譜(見圖2)中，H-3與δC165.1處的羰基碳(C-1)及C-5有明顯遠(yuǎn)程相關(guān)，H-4與δC200.3處羰基碳(C-6)及C-2有遠(yuǎn)程相關(guān)，說明這2個(gè)羰基碳分別與1，3共軛雙鍵上的C-2和C-5相連；H-7與C-9有相關(guān)，H-8與羰基碳C-6及C-10有相關(guān)，證明6位羰基碳與正丁基片段通過C-7相連；此外，H-1′與-3′、C-4′及C-1有相關(guān)，H-2′與C-4′有相關(guān)，證明-NH-CH2-CH-(CH3)2結(jié)構(gòu)片段與1位羰基碳相連。綜上所述，確定該化合物為(2E,4E)-N-isobutyl-6-oxodeca-2,4-dienamide。其1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)見表1?；衔?的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1的結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵1H-1H COSY、HMBC相關(guān)Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR波譜數(shù)據(jù)(500和125 MHz，CDCl3)Table 1 1H NMR and 13C NMR data ofcompound 1 (500 and 125 MHz,CDCl3)

圖3 化合物2的結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵1H-1H COSY、HMBC、NOE相關(guān)Fig.3 Key 1H-1H COSY,HMBC and NOE correlations of compound 2

化合物3無色油狀物；ESI-MS：m/z256 [M + H]+，分子式為C14H25NO3。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.23(1H，dd，J= 12.1，9.1 Hz，H-1′a)，2.74(1H，m，H-2a)，2.49(2H，m，H-1′a，2b)，2.48(2H，m，H-6)，2.30(1H，ddd，J= 14.3，10.3，4.9 Hz，H-3a)，2.11(1H，ddd，J= 14.3，10.3，7.0 Hz，H-3b)，1.87(1H，m，H-2′)，1.67(1H，m，H-7a)，1.65(1H，m，H-7b)，1.36(1H，m，H-9a)，1.30(1H，m，H-8a)，1.29(1H，m，H-9b)，1.28(1H，m，H-8b)，0.90(3H，t，J= 6.8 Hz，H-10)，0.88(6H，d，J= 6.8 Hz，H-3′，4′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：209.3(C-5)，175.0(C-1)，92.7(C-4)，47.8(C-1′)，34.8(C-6)，31.2(C-8)，30.2(C-3)，29.2(C-2)，27.9(C-2′)，23.4(C-7)，22.4(C-9)，20.3(C-3′)，20.4(C-4′)，13.8(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-4-hexanoyl-4-hydroxypyrrolidin-1-one。

化合物5白色無定形粉末；ESI-MS：m/z196 [M + H]+，分子式為C12H21NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.19(1H，dd，J= 15.0，10.4 Hz，H-3)，6.10(1H，m，H-4)，6.10(1H，m，H-5)，5.75(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，3.17(2H，t，J= 6.7 Hz，H-1′)，2.13(2H，q，J= 7.0 Hz，H-6)，1.79(1H，m，H-2′)，1.45(2H，m，H-7)，0.92(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 7.4 Hz，H-8)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.3(C-1)，143.0(C-3)，141.3(C-5)，128.4(C-4)，121.7(C-2)，46.9(C-1′)，35.0(C-6)，28.6(C-2′)，22.0(C-7)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，13.7(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-2E,4E-octadienamide。

化合物6無色結(jié)晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z224 [M + H]+，分子式為C14H25NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.20(1H，dd，J= 15.0，10.3 Hz，H-3)，6.11(1H，m，H-4)，6.11(1H，m，H-5)，5.78(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，3.18(2H，t，J= 6.7 Hz，H-1′)，2.15(2H，q，J= 7.0 Hz，H-6)，1.81(1H，m，H-2′)，1.43(2H，m，H-7)，1.30(4H，m，H-8，9)，0.94(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 7.0 Hz，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.4(C-1)，143.2(C-5)，141.3(C-3)，128.2(C-4)，121.8(C-2)，46.9(C-1′)，32.9(C-6)，31.4(C-8)，28.5(C-7)，28.6(C-2′)，22.5(C-9)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，14.0(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為pellitorine。

化合物7無色結(jié)晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z252 [M + H]+，分子式為C16H29NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.21(1H，dd，J= 15.0，10.2 Hz，H-3)，6.12(1H，m，H-4)，6.12(1H，m，H-5)，5.77(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，3.19(2H，t，J= 6.7 Hz，H-1′)，2.17(2H，q，J= 7.0 Hz，H-6)，1.81(1H，m，H-2′)，1.43(2H，m，H-7)，1.31(8H，m，H-8～11)，0.95(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 6.8 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.4(C-1)，143.3(C-5)，141.4(C-3)，128.2(C-4)，121.7(C-2)，46.9(C-1′)，33.0(C-6)，31.8(C-8)，29.1(C-7)，29.1(C-9)，28.8(C-10)，28.6(C-2′)，22.6(C-11)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，14.1(C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為N-isobuty-2E,4E-dodecadienamide。

化合物8白色無定形粉末；ESI-MS：m/z336 [M + H]+，分子式為C22H41NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.21(1H，dd，J= 15.0，10.1 Hz，H-3)，6.12(1H，m，H-4)，6.12(1H，m，H-5)，5.77(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，3.19(2H，t，J= 6.5 Hz，H-1′)，2.15(2H，q，J= 7.0 Hz，H-6)，1.81(1H，m，H-2′)，1.43(2H，m，H-7)，1.28(20H，m，H-8～17)，0.94(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 7.0 Hz，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.4(C-1)，143.3(C-3)，141.4(C-5)，128.2(C-4)，121.7(C-2)，46.9(C-1′)，33.0(C-6)，31.9(C-16)，29.5(C-7)，29.2～29.7(C-9～15)，28.8(C-8)，28.6(C-2′)，22.7(C-17)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，14.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-2E,4E-octadecadienamide。

化合物9無色結(jié)晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z238 [M + H]+，分子式為C15H27NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.21(1H，dd，J= 14.9，10.7 Hz，H-3)，6.11(1H，m，H-4)，6.11(1H，m，H-5)，5.77(1H，d，J= 14.9 Hz，H-2)，3.18(2H，m，H-1′)，2.16(2H，m，H-6)，1.60(1H，m，H-2′)，1.42(2H，m，H-7)，1.27(6H，m，H-8，9，3′)，0.94(6H，m，H-4′，5′)，0.90(3H，t，J= 7.4 Hz，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.5(C-1)，143.3(C-5)，141.4(C-3)，128.2(C-4)，121.7(C-2)，45.2(C-1′)，32.9(C-6)，31.4(C-8)，35.1(C-2′)，28.5(C-7)，27.0(C-3′)，22.5(C-9)，17.2(C-5′)，14.0(C-10)，11.3(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為N-(2′-methylbutyl)-2E,4E-decadienamide。

化合物10黃色結(jié)晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z334 [M + H]+，分子式為C22H39NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.19(1H，dd，J= 15.0，10.2 Hz，H-3)，6.09(1H，m，H-4)，6.09(1H，m，H-5)，5.74(1H，d，J= 15.0 Hz，H-2)，5.38(2H，m，H-12，13)，3.16(2H，t，J= 13.0，6.7 Hz，H-1′)，2.14(2H，m，H-6)，1.96(4H，m，H-11，14)，1.80(1H，m，J= 13.4，6.7 Hz，H-2′)，1.41(2H，m，H-7)，1.30(6H，m，H-15～17)，1.29(6H，m，H-8～10)，0.93(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)，0.88(3H，t，J= 7.0 Hz，H-18)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.4(C-1)，143.3(C-3)，141.4(C-5)，130.5(C-12)，130.2(C-13)，128.2(C-4)，121.7(C-2)，46.9(C-1′)，32.6(C-6)，32.6(C-11)，32.5(C-14)，32.5(C-16)，29.6(C-10)，29.3(C-15)，29.1(C-9)，29.0(C-8)，28.9(C-7)，28.6(C-2′)，22.6(C-17)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，14.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-2E,4E,12Z-octadecatrienamide。

化合物11無色結(jié)晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z226 [M + H]+，分子式為C14H27NO。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.85(1H，m，H-3)，5.77(1H，d，J= 15.2 Hz，H-2)，3.18(2H，t，J= 6.5 Hz，H-1′)，2.19(2H，q，J= 6.9 Hz，H-4)，1.81(1H，m，H-2′)，1.59(6H，m，H-5～7)，1.30(4H，m，H-8，9)，0.95(6H，d，J= 6.5 Hz，H-3′，4′)，0.90(3H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：166.3(C-1)，144.8(C-3)，123.5(C-2)，46.8(C-1′)，32.0(C-4)，31.8(C-8)，29.1(C-5)，29.1(C-6)，28.6(C-2′)，28.3(C-7)，22.6(C-9)，20.1(C-3′)，20.1(C-4′)，13.8(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為N-isobutyl-2E-decenamide。

化合物12黃色結(jié)晶(MeOH)；ESI-MS：m/z276 [M + H]+，分子式為C16H21NO3。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.76(1H，m，H-3)，6.69(2H，overlap，H-2′′，6′′)，6.64(1H，d，J= 8.0 Hz，H-4′′)，5.90(1H，d，J= 15.4 Hz，H-2)，5.87(2H，s，-OCH2O-)，3.03(2H，d，J= 6.8 Hz，H-1′)，2.68(2H，t，J= 7.5 Hz，H-5)，2.45(2H，q，J= 7.5 Hz，H-4)，1.76(1H，m，H-2′)，0.80(6H，d，J= 6.7 Hz，H-3′，4′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：167.3(C-1)，147.7(C-3′′)，145.9(C-4′′)，143.1(C-3)，134.9(C-1′′)，123.9(C-2)，120.9(C-6′′)，108.7(C-2′′)，107.6(C-5′′)，100.7(-OCH2O-)，46.5(C-1′)，34.0(C-5)，33.8(C-4)，28.3(C-2′)，19.1(C-3′，4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為二氫蓽茇明寧堿。

化合物13無色結(jié)晶(MeOH)；ESI-MS：m/z302 [M + H]+，分子式為C18H23NO3。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.90(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2′′)，6.79(2H，m，H-3，6′′)，6.71(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′′)，6.34(1H，d，J= 15.7 Hz，H-7)，6.08(1H，m，H-6)，5.97(1H，d，J= 15.4 Hz，H-2)，5.90(2H，s，-OCH2O-)，3.04(2H，d，J= 6.9 Hz，H-1′)，2.35(4H，m，H-4，5)，1.78(1H，m，H-2′)，0.90(6H，d，J= 6.8 Hz，H-3′，4′)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：167.7(C-1)，147.5(C-3′′)，147.5(C-4′′)，143.3(C-3)，132.1(C-1′′)，130.3(C-7)，126.9(C-6)，123.8(C-2)，120.1(C-6′′)，107.6(C-5′′)，104.9(C-2′′)，100.9(-OCH2O-)，46.5(C-1′)，31.6(C-5)，31.4(C-4)，28.3(C-2′)，19.1 (C-3′，4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物為風(fēng)藤酰胺。

2.2 體外神經(jīng)保護(hù)活性測試結(jié)果

采用MPP+損傷PC12細(xì)胞模型對化合物1～10進(jìn)行活性測試，檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較(100%)，模型組的細(xì)胞存活率顯著降低(68.60%)；與模型組比較，化合物6在20 μM時(shí)，細(xì)胞的存活率為73.78%，對MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷有非常顯著的保護(hù)作用(P< 0.01)，其余化合物對MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷無明顯保護(hù)作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從海風(fēng)藤二氯甲烷部位共分離得到酰胺類生物堿13個(gè)，其中化合物1為新化合物，化合物2為新天然產(chǎn)物，化合物3～7、9、10為首次從該植物中分離得到。藥理實(shí)驗(yàn)研究表明化合物6在20 μM時(shí)，對MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用(P< 0.01)，提示其對于帕金森病具有潛在的治療作用。本研究不僅進(jìn)一步豐富了海風(fēng)藤中酰胺生物堿類成分的結(jié)構(gòu)多樣性，對海風(fēng)藤中酰胺類生物堿在治療和預(yù)防神經(jīng)退行性疾病方面的研究亦具有一定的參考價(jià)值，同時(shí)對該屬植物后續(xù)化學(xué)成分及生物活性的研究具有一定的借鑒作用。