張 偉，陳雪潔，劉 蓉，沈 磊，田新雁，姜 北*

1大理大學(xué)藥物研究所；2大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大理 671000

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是一種尿酸(uric acid，UA)合成增加和(或)尿酸排泄減少所引起的代謝性疾病。高尿酸血癥是引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)性腎病等疾病的危險(xiǎn)因素[1]。近年來(lái)，全球痛風(fēng)的發(fā)病率持續(xù)提升[2-4]。目前對(duì)HUA治療的西藥有別嘌醇、苯溴馬隆和非布司他等，雖療效尚可，但均伴有肝腎毒性、藥疹及耐藥性等副作用[5]。因此，探尋有效且毒副作用小的藥物具有比較重要的意義。

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃，為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)植物，分心木(Diaphragma Juglandis Fructus，DJF)，為核桃果實(shí)子房室的木質(zhì)中隔，性平，無(wú)毒，具有健脾固腎的功效[6]。云南是我國(guó)核桃的起源地[7]，擁有獨(dú)具特色的漾濞泡核桃(JuglanssigillataDode)，漾濞彝族自治縣因此也享有“中國(guó)核桃之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，2020年產(chǎn)量達(dá)到5.7萬(wàn)噸，綜合產(chǎn)值10億元以上，成為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)。本課題組作為國(guó)內(nèi)最早從事相關(guān)研究的科研團(tuán)隊(duì)之一，曾于2009-2012年間對(duì)云南漾濞泡核桃分心木進(jìn)行了初步的研究，并且從中分離鑒定包括沒(méi)食子酸、大黃素、二氫槲皮素等近二十個(gè)成分，首次對(duì)核桃分心木中所含化學(xué)成分有了初步的認(rèn)識(shí)[8]。現(xiàn)代藥理研究表明，核桃分心木有補(bǔ)腎、抗氧化、抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫及抑制黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)等功效[9-11]，但核桃分心木對(duì)高尿酸血癥的作用迄今卻尚未見(jiàn)有報(bào)道。本文通過(guò)云南產(chǎn)核桃分心木干預(yù)HUA小鼠模型實(shí)驗(yàn)，探究分心木提取物對(duì)HUA的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種雄性小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全依照大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)及大理大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行(批準(zhǔn)文號(hào)：MECDU-202010-7)。

1.1.2 藥物和試劑

云南產(chǎn)分心木購(gòu)于云南省大理市漾濞縣。白介素1β、腫瘤壞死因子α(批號(hào)：20210312)購(gòu)于南京建成生物工程研究所；尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、總蛋白定量測(cè)試盒(批號(hào)：20201028)購(gòu)于南京建成生物工程研究所；別嘌醇、腺嘌呤、氧嗪酸鉀(批號(hào)依次為C1155486、C10984047、C11528491)購(gòu)于上海麥克林〗生化科技有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(批號(hào)：F20080523)購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Varisoskan LUX多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世科爾科技有限公司)；MCO-18AIC CO2孵育箱(日本三洋電器公司)；Tissuelyser-L多樣品組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；BX53F正置顯微鏡(Olympus公司)；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；H6小鼠獨(dú)立通氣籠(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)；Master-S30UVF純水機(jī)(上海和泰儀器有限公司)。

由于α-姜黃烯、α-姜烯和姜黃新酮等特征性共有峰對(duì)照品不易得，所以本實(shí)驗(yàn)選用β-石竹烯（S峰）為參照物，依據(jù)國(guó)家頒布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》，通過(guò)采用不同批次黃絲郁金藥材樣品，建立對(duì)照指紋圖譜，根據(jù)對(duì)照指紋圖譜的特征以及其參照峰（β-石竹烯），確定了22個(gè)共有峰。其中23號(hào)色譜峰雖然在每批樣品中也都存在，而且含量約占黃絲郁金揮發(fā)油的50%，卻并不是18批樣品的共有峰，原因是23號(hào)色譜峰可能是由于芳基姜黃酮和姜黃酮未達(dá)到分離而共同形成的一個(gè)色譜峰，實(shí)驗(yàn)中曾考察了不同色譜柱和不同升溫程序，但最終仍然未使之分離，如何優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件使之完全分離有待進(jìn)一步研究。

1.2 方法

1.2.1 供試樣品的制備

取干燥供試品，粉碎后過(guò)120目篩，得分心木干粉。取干粉200 g置于蒸餾瓶中，加入500 mL蒸餾水，85 ℃回流提取3次，冷卻后過(guò)濾，合并濾液，濃縮凍干(每1 g凍干粉折合生藥12.5 g)得分心木水提物樣品DJF-W。將DJF-W樣品分別用強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(FPC14Na)和強(qiáng)酸型苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(732型)處理，得去離子樣品DJF-S1和樣品DJF-S2。取分心木干粉按1∶3(m/V)比例加入75%乙醇，冷浸提取24 h，以相同條件提取5次，過(guò)濾，濃縮凍干(每1 g凍干粉折合生藥7.8 g)得分心木醇提取物樣品DJF-E。

1.2.2 高尿酸血癥小鼠模型的建立

依據(jù)文獻(xiàn)[12,13]，對(duì)昆明種雄性小鼠連續(xù)灌胃造模誘導(dǎo)劑氧嗪酸鉀(oxygen oxazine acid potassium，OXO)及腺嘌呤(adenine，Ade)可構(gòu)建小鼠高尿酸血癥模型。結(jié)合文獻(xiàn)[14,15]并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)劑劑量及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了探索，結(jié)果顯示以O(shè)XO-250 mg/kg + Ade-100 mg/kg的CMC-Na混懸液連續(xù)誘導(dǎo)21天，模型組小鼠腎臟出現(xiàn)明顯病變(見(jiàn)圖1)，表面出現(xiàn)褶皺、體積變小、顏色明顯變淺，從第8天開(kāi)始，給予誘導(dǎo)劑之后灌胃別嘌醇(10 mg/kg)治療，連續(xù)14天，別嘌醇組小鼠腎臟病變明顯減輕(見(jiàn)圖1)。小鼠體內(nèi)存在尿酸酶，影響高血尿酸的維持狀態(tài)，結(jié)合文獻(xiàn)[15,16]中給予誘導(dǎo)劑后血尿酸含量隨時(shí)間變化的趨勢(shì)和對(duì)給予誘導(dǎo)劑后適合的給藥時(shí)間的考察結(jié)果，結(jié)果表明：控制誘導(dǎo)劑和治療藥時(shí)間間隔1 h，末次給藥后1 h取血檢測(cè)血尿酸含量時(shí)，模型組血尿酸含量顯著高于正常組。運(yùn)用此方案研究分心木提取物降尿酸活性。

圖1 腎臟變化情況Fig.1 The pathological condition of the renal注：從左到右依次為正常組、模型組、別嘌醇組。Note:From left to right,they are normal group,model group and allopurinol group.

1.2.3 分心木提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的影響

1.2.3.1 動(dòng)物分組、給藥和處理

取110只昆明種雄性小鼠，分為11組(每組10只)，分別為正常組(normal group)、模型組(model group)、別嘌醇組(allopurinol group，10 mg/kg)；DJF-W高(H)、低(L)劑量組(2、1 g/kg)；DJF-E高、低劑量組(2、1 g/kg)；DJF-S1高、低劑量組(2、1 g/kg)；DJF-S2高、低劑量組(2、1 g/kg)(均為凍干粉劑量)。除正常組外，其余各組小鼠分別灌胃誘導(dǎo)劑，正常組給予等體積的CMC-Na，連續(xù)21天。前7天在給予造模誘導(dǎo)劑后1 h，各組灌胃蒸餾水；第8天，在給予誘導(dǎo)劑后1 h，正常組繼續(xù)灌胃蒸餾水、樣品組給予相應(yīng)樣品溶液、別嘌醇組給予別嘌醇10 mg/kg，連續(xù)14天[17]。

1.2.3.2 取材及生化指標(biāo)測(cè)定

末次給藥治療后1 h，各組小鼠眼球后靜脈叢取血，室溫靜置30 min后，3 500 rpm離心15 min，收集上層血清，置于-20 ℃?zhèn)溆?，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定尿酸(UA)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的含量；取肝臟，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性；取腎組織用4 ℃生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱(chēng)重，每只小鼠取50 mg左右組織，按1∶9的比例加入0.9%生理鹽水，機(jī)械勻漿。3 500 rpm，4 ℃離心10 min后取上清液得10%的腎臟組織勻漿。按試劑盒說(shuō)明書(shū)應(yīng)用ELISA法測(cè)定腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的水平。

1.2.3.3 腎組織形態(tài)學(xué)病變檢測(cè)

取相同部位腎組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后，常規(guī)取材、脫水、包埋、制片、HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并描述。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用mean ± SD在圖像上表示，SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVE)比較組間差異，P< 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 水提物樣品元素差異分析

通過(guò)檢測(cè)去離子樣品和水提物樣品中無(wú)機(jī)元素的含量，對(duì)比得出兩種去離子樣品無(wú)機(jī)元素去除率見(jiàn)表1，水提物、S1樣品、S2樣品三者之間無(wú)機(jī)元素含量存在差異。與S2樣品相比，S1樣本Zn、Ca、Mn、Cu、Mg元素的去除率較高，F(xiàn)e和Cr較低。

表1 兩種去離子樣品無(wú)機(jī)元素的去除率Table 1 Removal rate of inorganic elements in two deionized samples

2.2 分心木提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠的降尿酸作用

分心木提取物對(duì)小鼠血清中UA水平以及肝臟中XOD活性的影響情況見(jiàn)圖2。與正常組比較，模型組小鼠血清UA水平及肝臟XOD活性明顯升高(n= 10，P< 0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥別嘌醇顯著降低小鼠血清UA水平及肝臟XOD活性(n= 10，P< 0.01)，分心木各提取物各劑量均能不同程度的降低UA的水平和XOD的活性，其中分心木水提物高劑量及醇提物高劑量的效果最為顯著(n= 10，P< 0.01)，但均弱于別嘌醇；去離子樣品的效果相對(duì)較弱；各樣本組的效應(yīng)基本呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖2 分心木提取物對(duì)HUA小鼠模型血清UA和肝臟XOD的影響Fig.2 Effect of the extracts of DJF on the serum UA and XOD activity of the liver in HUA mice注：A：正常組；B：模型組；C：別嘌醇組；D：DJF-W(H)組；E：DJF-E(H)組，F(xiàn)：DJF-S1(H)組；G：DJF-S2(H)組；H：DJF-W(L)組；I：DJF-E(L)組；J：DJF-S1(L)組；K：DJF-S2(L)組；別嘌醇劑量為10 mg/kg，分心木提取物高、低劑量為2、1 mg/kg；與正常組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；下同。Note:A:Normal group;B:Model group;C:Allopurinol group;D:DJF-W(H) group;E:DJF-E(H) group;F:DJF-S1(H) group;G:DJF-S2(H) group;H:DJF-W(L) group;I:DJF-E(L) group;J:DJF-S1(L) group;K:DJF-S2(L) group.The dose of allopurinol was 10 mg/kg;the high dose and low dose of DJF extracts were 2 and 1 mg/kg.Compared with the normal group, *P < 0.05,**P < 0.01;Compared with the model group,*P < 0.05,**P < 0.01;the same below.

2.3 分心木提取物對(duì)高尿酸血癥小鼠腎組織及炎癥因子的影響

2.3.1 腎臟功能指標(biāo)

分心木提取物對(duì)小鼠血清中Cr和BUN水平的影響情況見(jiàn)圖3。與正常組相比較，模型組小鼠血清Cr及BUN水平明顯升高(n= 10，P< 0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥別嘌醇顯著降低小鼠血清Cr及BUN水平(n= 10，P< 0.01)，分心木各提取物各劑量組均能不同程度的降低這兩個(gè)指標(biāo)，其中分心木醇提物高、低劑量的效果最為顯著(n= 10，P< 0.01)，但弱于別嘌醇；水提物的降低效果次之，去離子樣品效應(yīng)最弱，各樣本組的效應(yīng)基本呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖3 分心木提取物對(duì)HUA小鼠模型Cr和BUN水平的影響 Fig.3 Effect of the extracts of DJF on the level of Cr and BUN in HUA mice

2.3.2 腎組織炎癥因子的測(cè)定

分心木提取物對(duì)小鼠腎臟組織中IL-1β和TNF-α水平的影響情況見(jiàn)圖4。與正常組相比較，模型組小鼠腎臟組織中IL-1β和TNF-α水平明顯升高(n= 10，P< 0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥別嘌醇顯著降低小鼠腎臟組織中IL-1β和TNF-α水平(n= 10，P< 0.01)，分心木各提取物各劑量組均能不同程度的降低這兩個(gè)指標(biāo)，其中云南分心木醇提物高、低劑量的效果最為顯著(n= 10，P< 0.01)，且強(qiáng)于別嘌醇；水提物效應(yīng)的效果次之，去離子樣品最弱，各樣本組的效應(yīng)基本呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。

圖4 分心木提取物對(duì)HUA小鼠模型IL-1β和TNF-α水平的影響 Fig.4 Effect of the extracts of DJF on the level of IL-1β and TNF-α in HUA mice

2.3.3 腎組織形態(tài)學(xué)病變檢測(cè)

分心木提取物對(duì)小鼠腎臟形態(tài)學(xué)的影響如圖5。將腎組織切片用HE染色，于400倍數(shù)不同視野下對(duì)各組進(jìn)行圖片采集，鏡下顯示正常組(n=5)腎小管邊界清晰，小管上皮細(xì)胞排列整齊，緊密。模型組(n=5)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，較多細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，腎小管擴(kuò)張明顯且細(xì)胞邊界不明顯，較多的腎小管壞死，腎小球嚴(yán)重?fù)p傷，表明氧嗪酸鉀和腺嘌呤可對(duì)腎臟結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重的破壞。與模型組相比，陽(yáng)性藥組(n=5)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，腎小管擴(kuò)張程度減輕，細(xì)胞形態(tài)正常，表明別嘌醇的治療效果明顯；分心木各提取物組(n=5)表現(xiàn)不同程度的病理變化，其中圖E病變程度最輕，圖D次之，余下各組具有明顯的結(jié)構(gòu)破壞，表明分心木高劑量的水提取物及醇提物可有效減輕腎臟結(jié)構(gòu)的損傷，其余劑量樣品治療效果相對(duì)較差。

圖5 小鼠腎臟病理切片(×400，標(biāo)尺：50 μm)Fig.5 Pathological section of mouse renal (×400,scale:50 μm)注：黑色箭頭指腎小管壞死；白色箭頭指腎小管擴(kuò)張；黑色圓圈指炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；黑色方框指腎小球損傷。Note:The black arrows indicate renal tubular necrosis;The white arrows indicate renal tubules dilate;The black circles indicate inflammatory cell infiltration;The black box indicates glomerular injury.

3 討論與結(jié)論

尿酸(UA)是嘌呤類(lèi)化合物代謝的終產(chǎn)物，黃嘌呤氧化酶是其代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，因此其活力可以作為評(píng)價(jià)機(jī)體生成尿酸能力的關(guān)鍵性指標(biāo)[18]。腎臟是人類(lèi)代謝UA的主要器官，UA易形成尿酸結(jié)晶在腎臟中沉積，可引發(fā)尿酸性腎損傷(uric acid nephropathy，UAN)[19]；并且可刺激強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，使得腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常[20]。

人類(lèi)在不斷進(jìn)化的過(guò)程中尿酸酶的基因突變導(dǎo)致尿酸酶失活，使得尿酸成為了嘌呤類(lèi)化合物代謝的最終產(chǎn)物。與人類(lèi)不同，嚙齒類(lèi)動(dòng)物可將尿酸通過(guò)尿酸酶進(jìn)一步分解，更易排出體外[21]。本研究給予昆明種小鼠氧嗪酸鉀和腺嘌呤，通過(guò)增加來(lái)源和抑制去路的方式聯(lián)合干預(yù)血尿酸水平，嚴(yán)格控制給予誘導(dǎo)劑后的取血時(shí)間，復(fù)制出既血尿酸水平顯著升高且有腎損傷的動(dòng)物模型，接近人類(lèi)患有高尿酸血癥的狀態(tài)。

傳統(tǒng)民族民間醫(yī)藥記載，分心木有固澀收斂、健脾固腎等功效[6]。近年來(lái)，分心木用途日趨廣泛，研究也越來(lái)越多。Jing等[11]對(duì)分心木中的成分進(jìn)行了體外抑制XOD活性的探究，結(jié)果表明部分其成分具有良好的抑制活性。結(jié)合抑制XOD活性和炎癥反應(yīng)是治療HUA引發(fā)腎損傷的有效靶點(diǎn)以及分心木的藥用記載和現(xiàn)代研究，本課題組進(jìn)行了分心木對(duì)高尿酸血癥小鼠治療作用的探究。結(jié)果表明，與模型組相比，分心木醇提物2 g/kg組的小鼠肝臟中XOD的活性水平明顯下調(diào)；血清中的UA含量也明顯下降。XOD是生成UA的關(guān)鍵控速酶，直接決定UA的生成量，表明云南分心木醇提物可以通過(guò)抑制XOD的活性，起到降低血UA含量的作用。尿酸結(jié)晶及游離態(tài)的尿酸可協(xié)同影響炎癥因子的表達(dá)，直接影響促炎癥細(xì)胞因子白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等其他炎癥因子的生成，IL-1β生成過(guò)量時(shí)可誘導(dǎo)腎小球硬化及系膜細(xì)胞發(fā)生增殖[22]，大量的TNF-α也會(huì)加劇炎癥反應(yīng)。云南分心木醇提物組的小鼠腎臟組織的炎癥因子TNF-α、IL-1β和血清中Cr、BUN的含量明顯低于模型組，表明分心木醇提物有清除炎癥因子的功效且優(yōu)于別嘌醇，也可下調(diào)間接表現(xiàn)腎功能的指標(biāo)Cr、BUN[23]，改善腎臟的功能。

微量元素生理生化功能非常廣泛，是機(jī)體正?；顒?dòng)的基礎(chǔ)[24]。例如，鋅元素是機(jī)體必需的營(yíng)養(yǎng)素和必要的還原劑[25]，也可在生殖和泌尿系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[26]。課題組前期研究結(jié)果顯示，云南分心木含有Cu、Zn、Fe、Mn、Mg等多種微量元素，為了驗(yàn)證云南分心木中的微量元素對(duì)治療HUA是否有作用，本研究將分心木水提物去除無(wú)機(jī)元素后的樣品同水提物進(jìn)行了藥效學(xué)對(duì)比，結(jié)果顯示，強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(FPC14Na)處理的去離子提取物DJF-S1中鋅元素的去除效果明顯高于強(qiáng)酸型苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(732型)處理的去離子提取物DJF-S2，同劑量下DJF-S1樣品對(duì)HUA小鼠的治療效果弱于DJF-S2樣本，且兩種去離子樣本對(duì)HUA小鼠的治療效果均弱于DJF-W樣本，表明分心木中富含的鋅元素可能是治療高尿酸血癥的重要成分，本研究為深入研究微量元素作用于高尿酸血癥的機(jī)制提供方向。

綜上所述，分心木醇提物具有改善腎功能、抑制XOD活性的作用以及抗炎的功效，一定程度上可降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平。目前西藥治療HUA有一定的優(yōu)勢(shì)，但不可忽視它的不良反應(yīng)，而植物藥在安全性高、多靶點(diǎn)協(xié)同治療方面有明顯優(yōu)勢(shì)，本文研究結(jié)果為后續(xù)的機(jī)制研究提供了重要的線(xiàn)索，明確了研究方向，對(duì)后期尋找高效低毒的有效成分提供了依據(jù)，同時(shí)也為分心木的開(kāi)發(fā)利用提供了新的思路。