高曉萌，趙綺悅，劉子騫，劉令今，陳格格，郝 娟，王香婷,2,3，許慶友,2,3*

1河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院；2河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，石家莊 050091

近年來(lái)，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率明顯增高，依據(jù)國(guó)家及人種不同為7%～12% ，其中中國(guó)的發(fā)病率為10.8%[1]。就CKD病因而言，單側(cè)梗阻性腎臟損傷持續(xù)進(jìn)展可以導(dǎo)致慢性腎衰竭的發(fā)生，其病理改變是腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)[2]。益氣活血解毒中藥是在總結(jié)國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)趙玉庸教授治療腎臟病的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合腎臟病理改變及炎癥損傷機(jī)制，采用黃芪15 g、茯苓10 g、芍藥12 g、地龍6 g、僵蠶6 g、黃芩10 g、金銀花10 g、大黃6 g組成，具有補(bǔ)虛扶正、解毒通絡(luò)的作用，用于慢性腎臟病的治療獲得滿(mǎn)意的臨床效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)益氣活血解毒中藥可以抑制氧化應(yīng)激、炎癥損傷等途徑減輕梗阻性腎病損傷，還可以調(diào)控自噬等途徑減輕對(duì)側(cè)腎臟的損傷[3-5]。本研究發(fā)現(xiàn)益氣活血解毒中藥可以調(diào)控VEGF途徑，抑制單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠對(duì)側(cè)腎臟淋巴管生成，減緩腎臟病進(jìn)展。本研究采用UUO制備梗阻性腎病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，給予益氣活血解毒中藥及醛固酮受體阻斷劑依普利酮治療，觀(guān)察鈉氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+-Cl-cotransporter，NCC)、血管內(nèi)皮生成因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor-1，LYVE-1)、平足蛋白(podoplanin，PDPN)等淋巴管新生相關(guān)指標(biāo)以及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(vimentin)等細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化指標(biāo)的表達(dá)，探討梗阻性腎病大鼠對(duì)側(cè)腎臟淋巴管新生并參與腎間質(zhì)纖維化的通路以及中藥的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只，7周齡，體重200±20 g，購(gòu)買(mǎi)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004。按照體質(zhì)量對(duì)大鼠進(jìn)行編號(hào)，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(UUO)、依普利酮治療組(EPL)和中藥治療組(TCM)，每組10只。購(gòu)買(mǎi)后于河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(冀)2017-005，光照時(shí)間為7∶00～18∶00。自由飲食，環(huán)境溫度24±1 ℃，濕度55%±5%。

1.2 儀器和設(shè)備

RM2245型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；CTS SP8激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；ODYSSEY雙色紅外激光成像掃描儀(美國(guó)LICOR公司)；DYY-12C型電泳儀及電泳槽(北京六一儀器廠(chǎng))；半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó) BIO-RAD公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申儀器公司)，VANOX DM-10AD型顯微照相儀(日本OLYMPUS株式會(huì)社)。

1.3 藥物與試劑

依普利酮飼料，美國(guó)Pfizer公司產(chǎn)品，輝瑞公司提供原粉，由日本Research Diets Inc公司根據(jù)動(dòng)物的進(jìn)食量與藥物用量100 mg/kg/d按1.25 g/kg加入飼料中，折合成大鼠藥物用量為100 mg/kg/d[6,7]；益氣活血解毒中藥(組成:黃芪2 袋、茯苓2袋、芍藥2袋、地龍1袋、僵蠶1袋、黃芩2袋、金銀花2袋、大黃1袋)由廣東一方制藥有限公司提供中藥配方顆粒，規(guī)格為每袋裝2.0 g，相當(dāng)于臨床使用量飲片10 g。按比例混勻煎煮15 min，水煎液含生藥0.43 kg/L，參照徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》折合大鼠用量為14 g/kg/d給藥。NCC抗體(Abcam公司，批號(hào)GR3274565-3)；VEGF-C抗體(Immunoway公司，批號(hào)YT5297)；VEGFR-3抗體(Immunoway公司，批號(hào)YT5878)；LYVE-1抗體(Novus公司，批號(hào)1808R01)；PDPN抗體(Bioss公司，批號(hào)AD06234578)；Vimentin抗體(Abcam公司，GR3186827-16)；α-SMA抗體(Abcam公司，批號(hào)GR3252482-10)；GAPDH抗體(Epitomics公司，批號(hào)Y123103P)；β-actin抗體(Abcam公司，批號(hào)GR305367-39)。

1.4 造模方法及給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，UUO組、EPL組和TCM組采用結(jié)扎單側(cè)輸尿管方法復(fù)制梗阻性腎病模型，異氟烷吸入麻醉后，于左側(cè)中腹部切開(kāi)皮膚，游離左側(cè)輸尿管，在輸尿管上1/3處用絲線(xiàn)結(jié)扎，切斷輸尿管，逐層縫合皮膚；Sham組僅游離輸尿管但不結(jié)扎。術(shù)后1天開(kāi)始給藥，EPL組給予依普利酮100 mg/kg/d加入飼料中喂養(yǎng)，TCM組化瘀解毒中藥煎劑14 g/kg/d灌胃，Sham組和UUO組給予等量普通飼料。10天后，異氟烷吸入麻醉，股動(dòng)脈取血，摘取對(duì)側(cè)腎臟(右側(cè)腎臟)，沿縱軸切開(kāi)，部分組織4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋，切片行常規(guī)HE、Masson及免疫組化染色；部分組織OCT包埋，切片行常規(guī)免疫熒光染色；剩余組織-80 ℃保存?zhèn)溆茫糜诜肿由飳W(xué)檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.5.1 HE、Masson染色觀(guān)察腎臟纖維化改變

HE染色：將石蠟切片置于二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水至蒸餾水；PBS清洗，蘇木精滴染5 min；PBS清洗，伊紅復(fù)染3 min，蒸餾水稍洗30 s，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封固。光學(xué)顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

Masson染色：將石蠟切片置于二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水至蒸餾水；PBS清洗，蘇木精滴染5 min；PBS清洗，Masson麗春紅酸性復(fù)紅液復(fù)染5 min，2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，不經(jīng)水洗，苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，以0.2%冰醋酸浸染片刻，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封固。光學(xué)顯微鏡觀(guān)察膠原表達(dá)。

1.5.2 免疫熒光法檢測(cè)NCC、LYVE-1、VEGF-C、VEGFR-3、α-SMA、Vimentin的表達(dá)

將冰凍切片用PBS沖洗3次，加入0.01 mol枸木緣酸緩沖液(PH6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加10%山羊血清，室溫孵育1 h；傾倒多余的山羊血清，滴加一抗(濃度為1∶100)，4 ℃過(guò)夜；PBS清洗，滴加二抗(避光)，37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)孵育1 h；滴加DAPI液(避光)室溫孵育10 min；滴加抗熒光衰減封片劑(避光)封片。

1.5.3 免疫組化法檢測(cè)LYVE-1、PDPN、VEGF-C、α-SMA、Vimentin的表達(dá)

采用免疫組化法觀(guān)察腎組織中LYVE-1、PDPN、VEGF-C、α-SMA、Vimentin的表達(dá)，石蠟切片脫蠟入水，修復(fù)抗原后加入一抗，4 ℃過(guò)夜；PBS清洗3次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，同上清洗3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，同上清洗3次，DAB顯色3～5 min，自來(lái)水充分沖洗，終止顯色；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀(guān)察蛋白表達(dá)的位置及染色強(qiáng)弱，以鏡下出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)以PBS替代二抗作為陰性對(duì)照。

1.5.4 Western blot檢測(cè)NCC、VEGF-C、VEGFR-3、α-SMA的表達(dá)

取新鮮腎臟組織100 mg，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗，加入含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的裂解液400 μL，勻漿取上清，測(cè)蛋白濃度后，根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)以20～50 μg樣品進(jìn)行電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗NCC、VEGF-C、VEGFR-3、α-SMA(1∶500～1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，清洗，室溫孵育二抗(1∶20 000)，洗掉多余二抗后Odyssey紅外顯影儀掃描顯影，與所得內(nèi)參進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織病理學(xué)改變

由圖1HE染色結(jié)果可知：Sham組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，腎間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管無(wú)擴(kuò)張；UUO組可見(jiàn)間質(zhì)出現(xiàn)水腫情況，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性或出現(xiàn)壞死脫落，腎小球未見(jiàn)明顯病變；EPL組及TCM組腎臟損傷較UUO組輕微。Masson結(jié)果顯示：Sham組腎間質(zhì)僅有少量纖維成分，結(jié)構(gòu)清晰；UUO組腎間質(zhì)膠原成分增多；EPL組及TCM組與UUO組比較，腎間質(zhì)膠原成分有所減少。

圖1 HE、Masson染色觀(guān)察UUO大鼠對(duì)側(cè)腎組織病理改變Fig.1 The pathomorphology of contralateral kidney of UUO rats by HE and Masson staining (Scale bar=100 μm)

2.2 免疫組化法檢測(cè)α-SMA、Vimentin的表達(dá)

免疫組化法顯示Sham組α-SMA及Vimentin僅表達(dá)于血管，腎間質(zhì)及上皮細(xì)胞表達(dá)較少；UUO組表達(dá)明顯增強(qiáng)，腎間質(zhì)及上皮細(xì)胞可見(jiàn)到陽(yáng)性表達(dá)；EPL組及TCM組α-SMA、Vimentin局部呈中度表達(dá)，間質(zhì)可見(jiàn)少量表達(dá)，較UUO組明顯減弱(見(jiàn)圖2)。

圖2 免疫組化染色檢測(cè)UUO大鼠對(duì)側(cè)腎組織α-SMA、Vimentin的表達(dá)Fig.2 Expression of α-SMA and Vimentin in contralateral kidney of UUO rats with immunohistochemistry

2.3 免疫熒光法檢測(cè)NCC的表達(dá)

由圖3可知，NCC僅在Sham組對(duì)側(cè)腎臟的遠(yuǎn)曲小管管腔親水側(cè)表達(dá)；UUO組大鼠對(duì)側(cè)腎臟NCC表達(dá)明顯增強(qiáng)；EPL組及TCM組表達(dá)范圍及強(qiáng)度較UUO組明顯減弱。

圖3 免疫熒光檢測(cè)UUO大鼠對(duì)側(cè)腎組織NCC表達(dá)Fig.3 Expression of NCC in contralateral kidney of UUO rats with immunofluorescence(Scale bar=75 μm)

2.4 免疫熒光及組化法檢測(cè)VEGF-C的表達(dá)

VEGF-C在Sham組大鼠對(duì)側(cè)腎臟表達(dá)較弱；在UUO組VEGF-C表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞；EPL組及TCM組VEGF-C的表達(dá)較UUO組明顯減弱(見(jiàn)圖4)。

圖4 免疫熒光及免疫組化檢測(cè)UUO大鼠對(duì)側(cè)腎組織VEGF-C的表達(dá)Fig.4 Expression of VEGF-C in contralateral kidney of UUO rats with immunohistochemistry and immunofluorescence

2.5 免疫熒光及組化法檢測(cè)VEGFR-3、LYVE-1、PDPN的表達(dá)

VEGFR-3、LYVE-1、PDPN在Sham組大鼠對(duì)側(cè)腎臟表達(dá)較弱；在UUO組VEGFR-3、LYVE-1、PDPN表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要見(jiàn)于對(duì)側(cè)腎臟血管周?chē)湍I小管間質(zhì)；EPL組及TCM組VEGFR-3、LYVE-1、PDPN的表達(dá)較UUO組明顯減弱(見(jiàn)圖5)。

圖5 免疫熒光及免疫組化檢測(cè)UUO大鼠對(duì)側(cè)腎組織VEGFR-3、LYVE-1、PDPN的表達(dá)Fig.5 Expression of VEGFR-3,LYVE-1 and PDPN in contralateral kidney of UUO rats with immunohistochemistry or immunofluorescence

2.6 免疫熒光法檢測(cè)LYVE-1與α-SMA及Vimentin的表達(dá)

由圖6可知，免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察LYVE-1與α-SMA 共表達(dá)，結(jié)果顯示Sham組大鼠僅在對(duì)側(cè)腎臟血管周?chē)?、腎小管間質(zhì)有少量LYVE-1(綠色)表達(dá)；UUO組對(duì)側(cè)腎臟血管周?chē)澳I小管間質(zhì)LYVE-1表達(dá)明顯增多，與α-SMA(紅色)表達(dá)相關(guān)并呈現(xiàn)共表達(dá)(黃色)；EPL組及TCM組LYVE-1與α-SMA表達(dá)均較UUO組減弱。LYVE-1 與Vimentin的共染結(jié)果與α-SMA相似(見(jiàn)圖7)。

圖6 免疫熒光檢測(cè)大鼠腎組織LYVE-1與α-SMA表達(dá)Fig.6 Expression of LYVE-1 and α-SMA in UUO rats with immunofluorescence(Scale=75 μm)

圖7 免疫熒光檢測(cè)大鼠腎組織LYVE-1與Vimentin表達(dá)Fig.7 Expression of LYVE-1 and Vimentin in UUO rats with immunofluorescence(Scale=75 μm)

2.7 Western blot檢測(cè)NCC、VEGF-C、VEGFR-3和α-SMA的表達(dá)

由圖8與表1可知，UUO組NCC、VEGF-C、VEGFR-3、α-SMA的表達(dá)均較Sham組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與UUO組相比，EPL組及TCM組NCC、VEGF-C、VEGFR-3、α-SMA的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 UUO大鼠對(duì)側(cè)腎組織NCC、VEGF-C、VEGFR-3和α-SMA蛋白Western blot灰度相對(duì)比值Table 1 Western blot gray scale relative ratios of NCC,VEGF-C,VEGFR-3 andα-SMA in the contralateral kidney of UUO rats = 3)

圖8 Western blot檢測(cè)UUO大鼠對(duì)側(cè)腎組織NCC、VEGF-C、VEGFR-3和α-SMA表達(dá)Fig.8 Expression of NCC，VEGF-C，VEGFR-3 and α-SMA in contralateral kidney of UUO rats with Western blot注：A：UUO大鼠對(duì)側(cè)腎組織NCC、VEGF-C、VEGFR-3和α-SMA 等蛋白Western blot數(shù)據(jù)；B：A中蛋白的灰度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與UUO組比較，△P<0.05，△△P<0.01。Note:A:Western blot data of proteins such as NCC,VEGF-C,VEGFR-3 and α-SMA in the contralateral kidney of UUO rats;B:Gray-scale statistical results of the protein in A.Compared with Sham,*P<0.05,**P<0.01;Compared with UUO,△P<0.05,△△P<0.01.

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，慢性腎臟病發(fā)病率明顯升高，現(xiàn)已成為全球關(guān)注的危害健康的公共性問(wèn)題。依據(jù)流行病學(xué)資料，目前我國(guó)農(nóng)村慢性腎臟病最為常見(jiàn)的原因是梗阻性腎病，其病理改變?yōu)槟I間質(zhì)纖維化[8]。我們的前期實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞增殖、細(xì)胞焦亡、巨噬細(xì)胞的集聚及表型轉(zhuǎn)化參與對(duì)側(cè)腎臟的損傷，近期研究發(fā)現(xiàn)淋巴管新生也在對(duì)側(cè)腎臟纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9]。

在正常腎臟中，淋巴管僅分布在小葉間和弓形動(dòng)脈周?chē)?，皮質(zhì)腎小管間質(zhì)區(qū)域若無(wú)損傷也少有淋巴管分布。然而，在腎小管間質(zhì)纖維化和炎性損傷區(qū)域，淋巴管生成明顯且管腔內(nèi)充滿(mǎn)單核細(xì)胞，生成的數(shù)量與腎小管間質(zhì)損傷程度有關(guān)[10,11]。目前公認(rèn)的淋巴管標(biāo)志物有：淋巴管透明質(zhì)酸受體1(LYVE-1)、平足蛋白(PDPN)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR-3)。LYVE-1是一種主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的膜蛋白，廣泛分布在淋巴管內(nèi)外腔面，參與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞從組織攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)透明質(zhì)酸鹽進(jìn)入淋巴液的過(guò)程；PDPN是一種存在于腎小管膜上皮細(xì)胞上的黏液樣跨膜糖蛋白，主要表達(dá)在人腎足突細(xì)胞、肺Ⅰ型上皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞以及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，但僅出現(xiàn)在小淋巴管；VEGFR-3屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物，為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF-C的特異性受體，主要表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，UUO術(shù)后10天，UUO組大鼠對(duì)側(cè)腎臟淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物L(fēng)YVE-1、PDPN及VEGFR-3表達(dá)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明淋巴管生成出現(xiàn)較早；考慮到細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化如腎小管上皮細(xì)胞、足細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化參與腎間質(zhì)纖維化的形成[13]，為了證實(shí)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞是否存在類(lèi)似改變，我們采用LYVE-1與細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志物α-SMA及Vimentin共染。α-SMA在腎組織表達(dá)的高低可以間接反應(yīng)肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量，因此α-SMA被廣泛作為向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的一項(xiàng)指標(biāo)；Vimentin是上皮細(xì)胞向肌成纖維轉(zhuǎn)化過(guò)程中的產(chǎn)物，腎臟疾病時(shí)，Vimentin的表達(dá)程度與腎小管損傷情況相關(guān)，因此Vimentin是間質(zhì)纖維化的間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白[14]。結(jié)果顯示UUO組大鼠LYVE-1與α-SMA、Vimentin均呈現(xiàn)共表達(dá)，說(shuō)明淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生肌成纖維細(xì)胞樣轉(zhuǎn)變，參與了梗阻性腎病對(duì)側(cè)腎臟纖維化的形成。

在眾多信號(hào)通路中，VEGF-C/VEGFR-3途徑是淋巴管生成最為關(guān)鍵的途徑[15]。VEGF有6個(gè)亞型，A、B、C、D和E，其中參與淋巴管新生的主要是C和D，腎小管上皮細(xì)胞等分泌VEGF-C和VEGF-D作用于淋巴管內(nèi)皮的同源受體VEGFR-3，誘導(dǎo)淋巴管和血管的生成[16,17]。VEGFR-3是淋巴管內(nèi)皮表達(dá)的酪氨酸激酶，是淋巴管的標(biāo)志物，VEGF-C與VEGF-D均可與之結(jié)合刺激其表達(dá)，其中VEGF-C的作用更為明顯[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，結(jié)扎大鼠單側(cè)輸尿管，對(duì)側(cè)腎臟VEGF-C表達(dá)明顯增強(qiáng)，與淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物L(fēng)YVE-1、VEGFR-3、PDPN的表達(dá)呈同樣趨勢(shì)；抑制VEGF-C的分泌可以減少UUO大鼠腎臟淋巴管的生成、抑制炎癥損傷，減輕腎間質(zhì)纖維化。

VEGF-C的過(guò)表達(dá)與組織水腫、缺血缺氧相關(guān)[19]，水鈉潴留是引起缺血缺氧的常見(jiàn)因素，NCC過(guò)表達(dá)參與這一病理生理改變。NCC是鈉氯離子協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要表達(dá)在遠(yuǎn)端小管，其親水的核心部分位于腎小管管腔側(cè)，依據(jù)管腔與細(xì)胞間的鈉離子梯度差異，將鈉、氯離子共同運(yùn)轉(zhuǎn)到小管細(xì)胞內(nèi)[20]。醛固酮調(diào)節(jié)NCC的表達(dá)，可引起鈉氯離子吸收過(guò)多導(dǎo)致組織水腫、缺血缺氧，刺激腎小管上皮細(xì)胞等分泌VEGF-C，促進(jìn)淋巴管新生[21-23]。

經(jīng)過(guò)臨床驗(yàn)證，中醫(yī)中藥在治療慢性腎臟病方面發(fā)揮著重要作用。慢性腎臟病屬于中醫(yī)水腫、尿血、尿濁等范疇，病至后期進(jìn)展為癃閉、關(guān)格等，總歸脾腎虧虛、濕邪濁毒內(nèi)蘊(yùn)所致。根據(jù)“久病必虛”“久病必瘀”“久病入絡(luò)”的中醫(yī)理論，結(jié)合臨床實(shí)踐和現(xiàn)代研究，我們認(rèn)為“虛、毒、瘀”是慢性腎臟病的基本病機(jī)，“虛為本，瘀為果，毒為兇”，因此擬定了益氣活血解毒中藥的治療。“整體觀(guān)念”是中醫(yī)學(xué)的基本特點(diǎn)，人體的各個(gè)組成部分之間生理上不可分割，病理上相互影響。腎臟病尤其是輸尿管梗阻引起的單側(cè)腎臟損傷，不僅影響自身，也可以影響對(duì)側(cè)，對(duì)側(cè)受損是導(dǎo)致慢性腎衰竭的重要因素，通過(guò)對(duì)“健側(cè)”腎臟的保護(hù)對(duì)于慢性腎病的治療具有臨床參考價(jià)值。

我們之前的研究已經(jīng)證實(shí)，在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中，UUO大鼠對(duì)側(cè)腎臟出現(xiàn)巨噬細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加重了對(duì)側(cè)腎臟的纖維化[24]；在短期實(shí)驗(yàn)中，UUO大鼠對(duì)側(cè)腎臟出現(xiàn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象，參與了對(duì)側(cè)腎損傷[9,25,26]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，單側(cè)腎臟損傷后對(duì)側(cè)腎臟的改變與淋巴管生成有關(guān)，在梗阻后早期就發(fā)生了改變，盡管程度較輕，但隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)明顯的纖維化改變。MR激活后，上調(diào)鈉氯離子協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NCC的表達(dá)，導(dǎo)致水鈉潴留引起組織缺血缺氧，刺激腎小管上皮細(xì)胞分泌VEGF-C誘導(dǎo)淋巴管生成，增生的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化(α-SMA、Vimentin)，參與間質(zhì)纖維化形成。益氣活血解毒中藥可調(diào)控VEGF通路，下調(diào)LYVE-1、VEGFR-3、PDPN的表達(dá)，抑制淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到減輕腎間質(zhì)纖維化的作用。

致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的各位老師及同學(xué)的幫助致以衷心的感謝！