汪祺，王曼虹，王亞丹，張樂帥，馬雙成*，文海若*

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州 215123

雷公藤多苷片（TPT）由衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordiiHook.f.根提取加工制成，具有抗炎和免疫抑制作用，臨床主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1]、腎病綜合征[2]、紅斑狼瘡、過敏性紫癜[3]等。其主要成分包括二萜類［雷公藤甲素（TP）］，三萜類［雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲（WA）］和生物堿類（雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤春堿、雷公藤對(duì)醌B）等。

現(xiàn)行國(guó)家藥品監(jiān)督管理局局頒標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-3350-98-2011）將雷公藤多苷片中的WA 列為含量測(cè)定項(xiàng)，規(guī)定含量值不得少于10 μg/片，將TP 列為檢查項(xiàng)，含量不得高于10 μg/片，而對(duì)其他成分未做明確規(guī)定[4]。研究表明，雷公藤多苷片中TP 是毒、效并存的成分，除具有一定肝、腎毒性外，可通過調(diào)控炎癥介質(zhì)、活化T 淋巴細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和類風(fēng)濕因子表達(dá)、影響基質(zhì)金屬類蛋白酶類和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）表達(dá)水平等機(jī)制發(fā)揮抗炎作用。此外，雷公藤紅素也可通過調(diào)節(jié)NF-κB 和熱休克蛋白70 抑制非特異性免疫應(yīng)答[5]。而雷公藤中其他成分，如多種生物堿的藥效作用目前研究較少。已有研究人員將不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的雷公藤多苷片進(jìn)行了化學(xué)成分指紋圖譜與小鼠體內(nèi)藥效學(xué)關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成分的差異直接影響該制劑在小鼠體內(nèi)的抗炎藥效[6]。因此，本研究以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 為體外炎癥模型，并以一氧化氮（NO）分泌水平和分化抗原簇86（CD86）表達(dá)水平為指標(biāo)，進(jìn)一步明確雷公藤多苷片主要成分的藥效作用，為闡釋雷公藤多苷片的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也將為科學(xué)合理地規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)中有效成分的測(cè)定限度提供重要的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 細(xì)胞

RAW264.7 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，本研究所用細(xì)胞為第八代。

1.2 儀器與試藥

LPS（Sigma 公司）、TP（批號(hào)：111567-201404，純度：99.8%）、WA（批號(hào)：111597-200505，純度：100%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；雷公藤紅素（批號(hào)：B20707，純度≥98%）、雷公藤春堿（批號(hào)：B20704，純度≥98%）；雷公藤次堿（批號(hào)：B20705）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；雷公藤晉堿（批號(hào)：E-0715，純度≥98%）購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；雷公藤對(duì)醌B（純度＞98%，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所）。雷公藤多苷片（涉及生產(chǎn)企業(yè)：A、B、C、D、E、F、G，此處以字母代表；H為在G企業(yè)產(chǎn)品中人為在每66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1，作為藥效學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)照）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（BI 公司）；1%青鏈霉素混合液、NO 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Gibco公司）；磷酸緩沖液（PBS，Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma 公司）；cell counting kit-8（cck-8，上海邁基生物科技有限公司）；PE-CD86 抗體（BD pharmingen公司）；利多卡因（Ark Pharm公司）；96 孔深孔板（上海泰坦科技股份有限公司）；96 孔未處理板（NEST 公司）；24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司）。

NEO ALPHA 131120d 型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；ckx31SF 型倒置顯微鏡［奧林巴斯（中國(guó)）有限公司］；2013-82090 型超凈工作臺(tái)（新加坡藝思高科技有限公司）；3111 型細(xì)胞培養(yǎng)箱、900 型超低溫冰箱［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；5427R 型高速冷凍離心機(jī)、5810R 型孔板離心機(jī)、Research plus 型移液器（德國(guó)艾本德有限公司）；ME204E/02型電子分析天平（梅特勒-托利多國(guó)際有限公司）；Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)（默克密理博生命科學(xué)有限公司）；DK-S22型恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；2016C 型全溫金屬?。êＸ偵镝t(yī)學(xué)工程有限公司）；FACS Verse型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；BCD-216TAM型冰箱（海爾集團(tuán)）。

2 方法

2.1 細(xì)胞活力

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于24孔板，于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h后，給予不同質(zhì)量濃度的單體（TP：2.5～160.0 ng·mL-1；雷公藤紅素：31.25～1 000.00 ng·mL-1；雷公藤對(duì)醌B：312.5～20 000.0 ng·mL-1；WA：62.5～4 000.0 ng·mL-1；雷公藤春堿、雷公藤次堿和雷公藤晉堿均為312.5～20 000.0 ng·mL-1），來自不同企業(yè)的TPT（A～G）質(zhì)量濃度為0～133.0 μg·mL-1，其中TP 及WA 含量見表1[7]。加樣后細(xì)胞于37 ℃、5% CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后每孔加入CCK-8 檢測(cè)試劑10 μL，37 ℃避光孵育2 h，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm 處的吸光度值（A），根據(jù)公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

表1 不同企業(yè)TPT中TP質(zhì)量濃度及作用于RAW 264.7細(xì)胞的IC50 μg·mL-1

參考半數(shù)抑制濃度（IC50）和細(xì)胞活性抑制結(jié)果，選擇IC50以上的濃度或最大無細(xì)胞毒性濃度為最高給藥濃度開展后續(xù)研究。

2.2 NO水平檢測(cè)

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于24 孔板，每孔500 μL。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h 后，分為空白組（無細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（有細(xì)胞但未加樣）、模型組LPS（0.1 μg·mL-1）組和LPS（0.1 μg·mL-1）組與不同質(zhì)量濃度受試物共處理給藥組，每組6 個(gè)復(fù)孔，分別添加含受試物的培養(yǎng)液500 μL。TP 的質(zhì)量濃度為2.5～40.0 ng·mL-1；雷公藤紅素質(zhì)量濃度為62.5～1000.0 ng·mL-1；雷公藤對(duì)醌B 質(zhì)量濃度為62.5～10 000.0 ng·mL-1；WA質(zhì)量濃度為250～4000 ng·mL-1；雷公藤春堿、雷公藤次堿和雷公藤晉堿質(zhì)量濃度均為1250～20 000 ng·mL-1，A～H 組TPT 的質(zhì)量濃度均為4.16～66.50 μg·mL-1。加樣后細(xì)胞于37 ℃、5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后每樣取50 μL 上清液添加于96 孔板，使用NO 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。每孔各添加試劑150 μL和試劑250 μL后混合均勻，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔540 nm 處的吸光度值。試驗(yàn)平行使用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（試劑盒提供）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于計(jì)算NO水平。

2.3 CD86檢測(cè)

細(xì)胞接種和分組同2.2 項(xiàng)下。TP 的質(zhì)量濃度為2.5～40.0ng·mL-1；雷公藤紅素為62.5～1000.0ng·mL-1；雷公藤對(duì)醌B 62.5～10 000.0 ng·mL-1；WA 250～4000 ng·mL-1；雷公藤春堿、雷公藤次堿和雷公藤晉堿均為1250～20 000 ng·mL-1，C 和D 組的TPT 的質(zhì)量濃度為4.16～16.63 μg·mL-1，其余各組和H 組TPT 質(zhì)量濃度均為4.16～33.25 μg·mL-1。加樣后細(xì)胞于37 ℃、5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后除去上清液，加入PBS 200 μL 重懸并轉(zhuǎn)移至4 ℃水浴中的96 孔板，在4 ℃條件下1000 r·min-1離心5 min（離心半徑為13.5 cm）。移除上清，每樣添加稀釋后的PE-CD86 抗體（1∶100，PBS）50 μL 后重懸，并于4 ℃孵育20 min（10 min 左右振蕩1 次）。之后添加PBS200 μL 并于4 ℃條件下1000 r·min-1離心5 min（離心半徑為13.5 cm）。移除上清液，再次添加PBS200 μL后重懸細(xì)胞備用。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)藻紅蛋白（PE）熒光強(qiáng)度，從而反映細(xì)胞CD86表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同企業(yè)TPT 和雷公藤主要單體成分對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

質(zhì)量濃度為0.52～133.00 μg·mL-1的TPT 與RAW264.7細(xì)胞作用24 h后，以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，其所含TP及WA質(zhì)量濃度（以66.67 mg·mL-1TPT為 計(jì)）及IC50見 圖1、表1。各企業(yè)TPT 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的IC50排序分別為C＜B＜F＜A＜H＜D＜E＜G。值得注意的是，G 企業(yè)的TPT 不含TP，H 是人為在G 企業(yè)每66.67 mg·mL-1TPT 中添加TP 100 μg·mL-1的對(duì)照組，前者IC50約為后者的77倍；而IC50最低的C 企業(yè)TPT 中TP 的含量為各家最低。上述結(jié)果表明，TP 含量是影響細(xì)胞活力的主要成分之一。但TP含量高低并不完全反映TPT對(duì)細(xì)胞活力抑制的強(qiáng)弱，TPT 中其他成分可能也對(duì)細(xì)胞活力有抑制作用。

圖1 不同企業(yè)TPT對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響（,n=3）

給藥24 h 后，不同質(zhì)量濃度的單體成分對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響見圖2，TP 對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用最強(qiáng)（IC50為26.11 ng·mL-1），其次為雷公藤紅素（IC50為618.6 ng·mL-1）、雷公藤對(duì)醌B（IC50為8649 ng·mL-1），其余單體成分在質(zhì)量濃度高達(dá)20 μg·mL-1時(shí) 對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞活力無影響。

圖2 不同雷公藤單體成分對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響（,n=3）

3.2 TPT 中主要單體成分及不同企業(yè)TPT 對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO水平的影響

空白和陰性對(duì)照組細(xì)胞上清液中只檢出極低含量的NO，而LPS（0.1 μg·mL-1）與RAW264.7 細(xì)胞作用24 h后，可生成大量NO（＞10 μmol·L-1；P＜0.001）。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所有企業(yè)TPT 均可抑制LPS 誘導(dǎo)的NO水平升高（E企業(yè)起效質(zhì)量濃度為8.31 μg·mL-1，其他企業(yè)均為4.16 μg·mL-1）。其中，企業(yè)A、C 中TPT 在質(zhì)量濃度為8.31 μg·mL-1時(shí)，企業(yè)B、D、E、F 及H 在TPT 質(zhì)量濃度為16.63 μg·mL-1時(shí)可將NO 水平抑制至接近空白對(duì)照組水平。G 企業(yè)TPT不含TP，對(duì)LPS 誘導(dǎo)的NO 水平的抑制作用最弱（圖3）。

圖3 不同企業(yè)TPT對(duì)NO水平的影響（,n=6）

TPT 中主要單體成分雷公藤紅素、雷公藤對(duì)醌B 分別自62.5、625.0 ng·mL-1起，對(duì)LPS 誘 導(dǎo)的NO生成水平產(chǎn)生抑制作用，該變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且隨單體質(zhì)量濃度增加抑制效應(yīng)更加明顯；此外，TP 質(zhì)量濃度為40 ng·mL-1時(shí)也可抑制LPS 誘導(dǎo)的NO 水平升高（P＜0.001，圖4）。其余單體成分在當(dāng)前給藥濃度范圍內(nèi)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的NO水平升高無影響。表明現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)WA 單體并無明顯抗炎活性，活性較強(qiáng)的成分為雷公藤紅素及雷公藤對(duì)醌B。

圖4 TPT主要單體成分對(duì)NO水平的影響（,n=6）

3.3 TPT 中主要單體成分及不同企業(yè)TPT 對(duì)CD86表達(dá)水平的影響

使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同受試物對(duì)RAW264.7細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86 的影響，并以平均熒光強(qiáng)度（MFI）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)?？瞻缀完幮詫?duì)照組的背景熒光強(qiáng)度較低，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS（0.1 μg·mL-1）刺激后，細(xì)胞表面CD86 的表達(dá)量顯著增加（MFI＞500，P＜0.001）。不同企業(yè)制劑中（圖5），除G 企業(yè)外，其他企業(yè)和H 組的TPT 均可抑制LPS 誘導(dǎo)的CD86 表達(dá)水平升高（F 企業(yè)TPT 起效質(zhì)量濃度為8.31 μg·mL-1，A～E 企業(yè)和H 組的TPT 起效質(zhì)量濃度均為4.16 μg·mL-1）。受試物對(duì)CD86 的影響與其對(duì)NO 水平的影響趨勢(shì)基本相符。TP、雷公藤紅素和雷公藤對(duì)醌B 分別在質(zhì)量濃度分別為5000、10 000、20 000 ng·mL-1時(shí)可抑制LPS 誘導(dǎo)的CD86增加，且變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001，圖6）。其他單體成分在當(dāng)前給藥濃度范圍內(nèi)未能抑制對(duì)LPS誘導(dǎo)的CD86表達(dá)量升高。表明現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)WA 單體并無明顯免疫抑制活性作用，活性較強(qiáng)的成分為TP、雷公藤紅素及雷公藤對(duì)醌B。

圖5 不同企業(yè)TPT對(duì)CD86表達(dá)水平的影響（,n=6）

圖6 TPT主要單體成分對(duì)CD86表達(dá)水平影響（,n=6）

4 討論

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)外源性或內(nèi)源性刺激的一種防御性反應(yīng)，參與關(guān)節(jié)炎、腎損傷、自身免疫疾病等多種病理過程。其中NO 是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵關(guān)節(jié)，抑制其過度表達(dá)，可有效緩解炎癥癥狀[8]。本研究所用的RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)LPS、γ-干擾素（IFN-γ）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GMCSF）激活后轉(zhuǎn)化為M1型巨噬細(xì)胞，后者可產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，包括分泌大量白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子（TNF）、IL-12、IL-18，CD80、CD86共刺激因子呈高表達(dá)，以及激活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS2或iNOS）產(chǎn)生NO。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP、雷公藤紅素和雷公藤對(duì)醌B 均對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的活力有一定影響，抑制LPS 誘導(dǎo)的NO 和CD86 水平增加，提示三者為雷公藤多苷片中主要抗炎成分。TP 可抑制TNF-α刺激引起的環(huán)氧化酶-2（COX-2）和iNOS 的表達(dá)，并誘導(dǎo)前列腺素E2（PGE2）和NO 大量合成[9]。TP 在低濃度作用下可通過調(diào)控半胱天冬酶活性來抑制類風(fēng)濕化膜細(xì)胞活性[10]，從而減少滑膜成纖維的過度增生，發(fā)揮治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。雷公藤紅素也參與多種炎癥信號(hào)通路的調(diào)控，如阻斷細(xì)胞核因子κB抑制物激活酶（IκB）的活性，抑制NF-κB 的活化及其核轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等[11]。關(guān)于雷公藤對(duì)醌B 的藥效作用的報(bào)道較少，Takaishi 等[12]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤對(duì)醌B 是IL-1 抑制劑，有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用，但具體的作用通路尚不明確，本結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了雷公藤對(duì)醌B 的體外抗炎作用。值得注意的是，當(dāng)前TPT的質(zhì)量控制成分WA未表現(xiàn)出抗炎作用。

通過比較不同企業(yè)TPT 發(fā)現(xiàn)，所有TPT 均可拮抗LPS 誘導(dǎo)的炎癥效應(yīng)。TPT 中TP 含量為影響RAW264.7 細(xì)胞活力，并拮抗LPS 誘導(dǎo)的NO 和CD86 水平升高的主要因素之一。但TP 含量最低的C 企業(yè)TPT 也可在較低濃度對(duì)上述炎癥指標(biāo)產(chǎn)生抑制作用，各企業(yè)TPT的抗炎作用與的TP含量并不完全呈正相關(guān)，因此，提示雷公藤紅素、雷公藤對(duì)醌B 等其他單體成分均與TPT 的藥效相關(guān)。因此提示，仍需進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)TPT 中雷公藤對(duì)醌B、雷公藤紅素等主要單體成分的藥效學(xué)研究，明確TPT 中各成分的含量與其藥效的內(nèi)在聯(lián)系，才能更加合理科學(xué)地規(guī)范該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床用藥的有效性、安全性。