陳巧云，楊柳，劉斌，李文鵬，李偉，谷建梅，黃昕紅，尤棵，王業(yè)秋

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

隨著全球經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，臭氧層破壞加劇，輻射到地球表面的紫外線（Ultraviolet Ray，UV）日益增多。皮膚是UV 作用于人體的主要靶器官，長期的UV 照射可使其結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變，導(dǎo)致光老化的發(fā)生，出現(xiàn)粗深皺紋、皮膚下垂、色斑等臨床表現(xiàn)［1］。到達(dá)地表的紫外線中，長波紫外線（UVA，320 nm～400 nm）占總量的95%，且穿透力強(qiáng)，能直接損傷皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞功能紊亂，是引起皮膚光老化的主要因素［2-3］。

國內(nèi)外學(xué)者針對UV 損傷皮膚的機(jī)制及皮膚光老化的預(yù)防和治療進(jìn)行了大量研究，取得了一定效果，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了臨床需求［4-5］。本課題組在杜仲抗皮膚光老化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，京尼平苷（geniposide，GP）是杜仲抗皮膚光老化的活性物質(zhì)之一，能減輕UVA 損害皮膚成纖維細(xì)胞［6］。本實(shí)驗(yàn)主要研究GP 對皮膚成纖維細(xì)胞活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的清除、細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、Bcl-2 mRNA 表達(dá)的影響，探討GP 抗皮膚光老化的機(jī)制，為皮膚光老化的防治及GP的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人皮膚成纖維細(xì)胞HSF（上海艾研生物科技有限公司）。

1.2 藥物與試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清［賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司］；ROS 檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）測試盒、Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；引物、SGExcel UltraSYBR Mixture、AMV 第一鏈cDNA 合成試劑盒［生工生物工程（上海）有限公司］；京尼平苷（上海銳谷生物科技有限公司）。

1.3 儀器

紫外照射儀（Sigma 公司）；紫外線輻照計(jì)（北京師范大學(xué)光電儀器廠）；流式細(xì)胞儀（HPC-150 型，加拿大Handyem公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（MX3000P型，美國安捷倫公司）。

2 方法

2.1 藥物配制

GP 用DMEM 培 養(yǎng)液 配制 成5 × 10-7、5 × 10-6、5 × 10-5mol/L 三個(gè)濃度，調(diào)整pH 值為7.0，微孔濾膜（0.22 μm）過濾除菌。

2.2 HSF細(xì)胞的體外培養(yǎng)及模型建立

HSF 細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，在5%CO2、37 ℃、飽和濕度的環(huán)境下培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的HSF細(xì)胞制備成1×106、5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液分別接種于6孔板和96 孔板。參考文獻(xiàn)［6］和［7］的方法，用20 J/cm2的UVA照射細(xì)胞建立光老化模型。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

接種于孔板內(nèi)的細(xì)胞隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組和藥物處理組，其中藥物處理組又分為5×10-7、5×10-6、5×10-5mol/L 三個(gè)濃度。①正常對照組：不含GP的DMEM培養(yǎng)液正常培養(yǎng)；②模型對照組：UVA照射建立光老化模型，不含GP的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；③藥物處理組：UVA 照射建立光老化模型，分別給予含5×10-7、5×10-6、5×10-5mol/L GP的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力

接種到96 孔板的細(xì)胞，給藥干預(yù)24 h，每孔加5 mg/mL 的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后加入150 μL 二甲基亞砜，室溫震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，置于酶標(biāo)儀中，檢測492 nm 處的吸光度（OD），計(jì)算細(xì)胞活力。

2.5 細(xì)胞中活性氧水平檢測

6 孔板中細(xì)胞，給藥24 h 后，使用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。

2.6 LDH活性檢測

96 孔板中細(xì)胞，給藥24 h 后，收集上清液，檢測LDH活性，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

2.7 細(xì)胞凋亡率檢測

6 孔板中細(xì)胞，給藥24 h 后，使用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

2.8 p53、Bax和Bcl-2 mRNA檢測

6孔板中細(xì)胞，給藥24 h后，提取每孔總RNA；按照第一鏈cDNA 合成試劑盒步驟要求合成cDNA；以該cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系：20 μL；反應(yīng)引物：p53，F(xiàn) 5'-ACCACCATCCACTACAACTACAT-3'、R 5'-CAGGACAGGCACAAACACG-3'；Bax，F(xiàn) 5'-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3'、R 5'-GTGTCCACGGCGGCAATCA-3'；Bcl-2，F(xiàn) 5'-ATCCAATCCTGTGCTGCAT-3'、R 5'-ACGTCCACGTTCTTCATTGT-3'；以β-actin 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法，對p53、Bax和Bcl-2 mRNA進(jìn)行分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 GP對HSF細(xì)胞活力的影響

20 J/cm2的UVA 照 射 后，細(xì) 胞 活 力 減 弱（P＜0.01），GP 各劑量組能提高細(xì)胞活力，5 × 10-6、5 ×10-5mol/LGP 組與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 GP對HSF細(xì)胞活力的影響（±s）

表1 GP對HSF細(xì)胞活力的影響（±s）

注：與模型對照組比較，2）P ＜0.01。

組別正常對照組模型對照組5×10-7 mol/L GP 5×10-6 mol/L GP 5×10-5 mol/L GP n 3 3 3 3 3 OD值0.986±0.1062）0.541±0.059 0.624±0.071 0.792±0.0842）0.881±0.0932）細(xì)胞活力（%）100.0 54.9 63.3 80.3 89.4

3.2 GP 對HSF 細(xì)胞ROS 相對含量、LDH 活性、細(xì)胞凋亡的影響

UVA 照射后，ROS 相對含量增加、LDH 活性和細(xì)胞凋亡率升高，與正常對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），GP 干預(yù)后，ROS 相對含量、LDH 活性和凋亡率下降（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 GP對HSF細(xì)胞ROS相對含量、LDH活性和細(xì)胞凋亡率的影響（±s）

表2 GP對HSF細(xì)胞ROS相對含量、LDH活性和細(xì)胞凋亡率的影響（±s）

注：與模型對照組比較，1）P ＜0.05，2）P ＜0.01。

組別正常對照組模型對照組5×10-7 mol/L GP 5×10-6 mol/L GP 5×10-5 mol/L GP n 3 3 3 3 3 ROS相對含量（%）100.002）238.67±27.28 207.31±21.35 165.24±18.171）131.55±12.912）LDH活性（U/L）409.74±42.312）972.48±99.25 904.52±89.76 622.39±69.432）519.51±53.472）細(xì)胞凋亡率（%）9.32±1.172）25.47±3.61 20.54±2.25 15.59±1.982）12.35±1.362）

3.3 GP對p53、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

20 J/cm2UVA 照射后，HSF 細(xì)胞p53、Bax mRNA 的表達(dá)量顯著上升，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Bcl-2 mRNA 表達(dá)量基本沒變化，與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；GP 各劑量組可降低p53、Bax mRNA 的表達(dá)，提高Bcl-2 mRNA的表達(dá)，5×10-6、5×10-5mol/L GP 組與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1和表3。

表3 GP對HSF細(xì)胞p53、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響（±s）

表3 GP對HSF細(xì)胞p53、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：與模型對照組比較，1）P ＜0.05，2）P ＜0.01。

組別正常對照組模型對照組5×10-7 mol/L GP 5×10-6 mol/L GP 5×10-5 mol/L GP n 3 3 3 3 3 mRNA相對表達(dá)量p53 1.00±0.152）2.47±0.33 2.15±0.31 1.77±0.171）1.38±0.152）Bax 1.00±0.132）2.14±0.29 1.98±0.22 1.56±0.191）1.29±0.162）Bcl-2 1.00±0.122）0.98±0.11 1.34±0.16 1.59±0.221）1.92±0.242）

圖1 GP對p53、Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

4 討論

京尼平苷又名梔子苷，是一種環(huán)烯醚萜類化合物，主要存在于梔子、杜仲等植物中，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種藥理作用［8-9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)尼平苷能提高SOD、GSH-Px 等酶的活性，通過調(diào)控MAPK 信號通路，減少炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和分泌，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，提高基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子的分泌來保護(hù)UV 損傷的皮膚細(xì)胞［6］。為了進(jìn)一步探究京尼平苷抗皮膚光老化的作用機(jī)制，筆者以人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）作為研究對象，研究京尼平苷處理UV 照射后的HSF 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白mRNA 表達(dá)的影響，為皮膚光老化的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

在皮膚光老化的各種機(jī)制中，研究比較多的是氧化應(yīng)激學(xué)說，認(rèn)為皮膚細(xì)胞在UV 照射下發(fā)生一系列生化反應(yīng)產(chǎn)生ROS，ROS 既可以直接引起細(xì)胞的氧化性損傷，使細(xì)胞內(nèi)的酶類失活；又可以作為第二信使，激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控MMPs 基因表達(dá)［10-11］。本研究中，20 J/cm2的UVA 照射后，細(xì)胞內(nèi)ROS 相對含量增加，培養(yǎng)液中LDH 活性增強(qiáng)，凋亡率增加，細(xì)胞活力下降為正常對照組的54.9%，說明UVA 照射引起HSF 細(xì)胞的氧化損傷。GP 干預(yù)后，ROS相對含量、LDH 活性和凋亡率降低，細(xì)胞活力增加，說明GP 通過提高細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)活力，清除ROS，增加細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，拮抗UVA 對皮膚成纖維細(xì)胞的損傷。

細(xì)胞內(nèi)過量的ROS會(huì)產(chǎn)生大量的凋亡轉(zhuǎn)錄因子，引起細(xì)胞凋亡［12］。哺乳動(dòng)物中有一系列凋亡相關(guān)基因，比較重要的有胱天蛋白酶（Caspases）家族、Bcl-2 家族、ice 基因、p53基因等。Bcl-2家族是一類癌基因家族，其成員如Bcl-2等抑制細(xì)胞凋亡，也被稱為存活基因；有的促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如Bad、Bax等。Bax與Bcl-2這一對相互拮抗的基因共同對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響［13］。Bax蛋白可破壞線粒體膜的完整性，降低膜電位，增加細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase蛋白家族，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bcl-2可維護(hù)線粒體膜的完整性，抑制細(xì)胞凋亡。以抑癌基因p53為核心的信號通路是UV照射誘發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)［14］。UV照射激活p53基因，表達(dá)的p53蛋白與線粒體膜上的Bcl 蛋白家族相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15-16］。在本研究中，與空白對照組相比，UVA照射后，p53、Bax mRNA 表達(dá)量上升（P ＜0.01），Bcl-2 mRNA表達(dá)量無明顯下降（P＞0.05）。GP 處理后，p53、Bax mRNA 表達(dá)量下降，Bcl-2 mRNA 表達(dá)量升高（P＜0.05），表明GP 通過下調(diào)p53、Bax mRNA 表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

綜上，京尼平苷通過調(diào)控光損傷HSF 細(xì)胞活力和細(xì) 胞 內(nèi)ROS 含 量、LDH 活 性；調(diào) 控p53、Bax 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)通路，拮抗細(xì)胞的氧化損傷，減少細(xì)胞凋亡，防治皮膚光損傷。