貢旭楠 饒艷偉

肝癌是一種最常見的惡性腫瘤，在癌癥的死亡率中排在第二位。肝癌的誘因包括遺傳因素、慢性病毒感染、非酒精性脂肪肝、吸煙和長期酗酒等，而且會持續(xù)影響肝癌的轉歸，但其分子作用機制至今還不清楚。臨床治療肝癌的主要方法包括：手術治療、化療和肝移植等，治療后存在生存率低和轉移的情況。mi RNAs是一種沒有編碼的RNA，長度約為22個核苷酸組成，可以直接靶向3’-UTR mRNA，引起mRNA的降解和抑制翻譯過程，在細胞中扮演著調控基因表達的作用。研究證明miRNAs是癌癥發(fā)生、發(fā)展的主要調控基因，功能為致癌基因或抑癌基因，調控細胞的分化、侵襲和轉移。有研究顯示在肝癌中存在很多的miRNAs功能紊亂，其可能參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展的過程。研究顯示miR-300在肝癌組織和細胞中存在高表達，但是也有研究表明其低表達[1-4]?，F(xiàn)階段針對miR-300在肝癌中的分子作用機制還不明確，影響的下游目的基因還不清楚。因此，本研究針對miR-300對肝癌的分化、轉移的分子機制做進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

miR-300 mimic(The sequences of miR-300 were as follows：Sense，5'-UAU ACA AGG GCA GAC UCU CUC U-3'；anti-sense，5'-AGA GAG AGU CUG CCC UUG UAU A-3'.)；miR-300 引物：5'-TAT ACA AGG GCA GAC TCT CTC T-3'(Forward)，U6：5'-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT CGT-3'(Reverse)；ROCK1引物：5’-AGGA AGGCGGACATATTAGTCCCT-3’(Forward)，5’-AGAC GATAGTTGGGTCCCGGC-3’ (Reverse)；GAPDH 引物：5'-CAT GAG AAG TAT GAC AAC AGC CT-3'(Forward)，5'-AGT CCT TCC ACG ATA CCA AAG T-3'(Reverse)；pcDNA3.1 Vector訂購于美國Thermo Fisher Scientific，Inc.；ROCK1蛋白抗體訂購于Abcam。

1.2 細胞培養(yǎng)

肝癌細胞HepG2、Huh-7和人正常肝細胞HL-7702細胞為吉林省人民醫(yī)院中心實驗室贈予。HepG2和Huh-7細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并保持一定的濕度。所有細胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR檢測肝癌組織和細胞中的miR-300和ROCK1的表達水平

根據(jù)TRIzol試劑盒(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.)提取組織和細胞中總RNA，依照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 試劑盒(Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.) 在如下條件16 °C，30 min；42 °C，30 min；85 °C，5 min。cDNA合成通過Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase 試劑盒(Takara Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China) 條件：37 °C，15 min；72 °C，10 min，qPCR 擴增采用Power SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems；Thermo Fisher Scientific，Inc.)條件：95 °C，10 min；40 個循環(huán)：95 °C 15 s和 60 °C，60 s。

1.4 Western Blot檢測HepG2和Huh-7細胞中ROCK1蛋白表達

提取細胞總蛋白，Bio-Rad法測定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟操作，測定樣品的蛋白濃度。用Image J圖像處理軟件計算各條豆類灰度值，分析ROCK1蛋白表達情況。目的蛋白與內參照β-肌動蛋白(β-actin)的灰度值的比值進行描述表達情況。

1.5 MTT檢測HepG2和Huh-7細胞增殖率

按使用說明書用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)法檢測細胞生存能力。全自動酶標儀(波長570 nm)測定各孔OD值，計算細胞生存率。

1.6 流式細胞術檢測Sub-G0/G1值

肝癌HepG2和Huh-7細胞在轉染miR-300 mimic后，收集細胞，加入70%的乙醇，通過碘化丙啶(PI，200 mg/ml)固定，之后通過Aria Ⅱ sorter流式細胞儀分析(BD Biosciences)，每組計數(shù)10000個細胞，統(tǒng)計出Sub-G0/G1值。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測肝癌組織和細胞中miR-300和ROCK1的表達水平

與正常組織相比，肝癌組織中miR-300的表達水平明顯降低(P<0.001)，如圖1A，ROCK1的表達水平明顯增加(P<0.001)如圖1C。與人正常肝細胞HL-7702相比，肝癌細胞HepG2和Huh-7中miR-300的表達水平明顯降低(P<0.001)，如圖1B，ROCK1的表達水平明顯增加(P<0.001)如圖1D。

圖1 RT-qPCR檢測肝癌組織和細胞中miR-300和ROCK1的表達

2.2 轉染miR-300 mimic后，HepG2和Huh-7細胞中ROCK1的表達

與Scrambled Control相比，qPCR結果表明miR-300 mimic組的ROCK1的表達水平明顯降低(P<0.001)，如圖2A、C。Western blot結果表明miR-300 mimic組的ROCK1的表達水平明顯降低(P<0.001)，如圖2B、D。

圖2 qPCR和Western blot檢測肝癌細胞ROCK1表達

2.3 轉染miR-300 mimic后，MTT法和流式細胞術檢測HepG2和Huh-7細胞增殖率和Sub-G0/G1比值

MTT結果表明：HepG2和Huh-7細胞隨著miR-300 mimic作用時間的增加，細胞增殖率明顯降低(P<0.001)，圖3A；流式細胞術結果表明：與Scrambled Control相比，miR-300 mimic組的Sub-G0/G1比值水平明顯增加(P<0.001)，圖3B。

圖3 MTT法和流式細胞術檢測HepG2和Huh-7細胞增殖率和Sub-G0/G1比值

3 討論

針對miR-300的研究還比較少，在腫瘤組織中的作用還存在歧義。本研究發(fā)現(xiàn)miR-300在肝癌組織和細胞中存在低表達，Xinye Zhang[1]、Yufo Chen[5]和RongchangWang[2]的研究結果與本研究結果一致，但是Junkai Zhang[3]的研究證明miR-300在肝癌組織和細胞中的表達增高，其研究結果與本研究相反。因此，本研究證實了miR-300在肝癌組織和細胞中低表達，與大多數(shù)研究結果一致，具有可信度。研究同時發(fā)現(xiàn)ROCK1的表達明顯增加，與miR-300呈負相關。為了證明miR-300是否通過影響ROCK1的表達，給予miR-300模擬物轉染，發(fā)現(xiàn)能降低肝癌細胞HepG2和Huh-7中的ROCK1的基因和蛋白水平的表達，因此研究證實了可以通過提高miR-300表達來降低ROCK1的表達來影響肝癌細胞的轉歸，同時檢測肝癌細胞的增殖和分化能力發(fā)現(xiàn)miR-300模擬物作用在36 h后細胞增殖率下降，特別是在48 h后有顯著的統(tǒng)計學意義，而在48 h細胞的Sub-G0/G1比值顯著增加，說明肝癌細胞停止增殖和分化。在Fucheng Zhou[4]的研究中發(fā)現(xiàn)miR-300可以通過抑制ROCK1的表達來影響腦膠質瘤的轉歸，其研究的作用機制與本研究一致。

綜上，本研究證實了miR-300可以通過抑制ROCK1影響肝癌的增殖和分化，miR-300有可能作為肝癌治療的一個新靶點。