高惠芳，邵明龍，張顯，楊套偉，徐美娟，高曉冬，饒志明

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

三萜類化合物是一類由多個異戊二烯單位(C5H8)構(gòu)成的烴類及其含氧衍生物，通常是由30個碳原子組成。結(jié)構(gòu)上多為四環(huán)三萜或五環(huán)三萜，其中，五環(huán)三萜化合物種類較多，而且結(jié)構(gòu)復雜，廣泛存在于植物中，具有多種藥理學功能，如齊墩果酸片等藥品已在臨床應(yīng)用于肝臟保護[1-2]。根據(jù)構(gòu)型不同，五環(huán)三萜化合物可分為烏蘇烷型(ursane group)、羽扇豆烷型(lupane group)和齊墩果烷型(oleanane group)等。α-香 樹脂醇(α-amyrin)及其衍生物是重要的烏蘇烷型五環(huán)三萜，具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗真菌[5]等功效；羽扇豆醇(lupeol)及其衍生物是羽扇豆烷型五環(huán)三萜的代表，在抗炎[6]、抗癌[7]等方面具有非常重要的作用；計曼尼醇(germanicol)及其衍生物屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和精細化工品等領(lǐng)域[8]。目前五環(huán)三萜化合物主要從植物中提取得到，此方法耗時、成本高、環(huán)境不友好，隨著合成生物學的快速發(fā)展，利用微生物實現(xiàn)萜類化合物的異源生產(chǎn)得到了越來越多的關(guān)注[9-10]。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為一種安全的真核模式微生物，遺傳背景清晰，遺傳操作技術(shù)成熟，具有生物合成萜類物質(zhì)的甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑，其完整的細胞內(nèi)膜系統(tǒng)更加有利于萜類合成相關(guān)環(huán)化酶和細胞色素P450氧化酶的表達，已被廣泛用于構(gòu)建生產(chǎn)天然萜類活性物質(zhì)的底盤工程菌株[11-13]。YU等[14]將α-香樹脂醇合酶(α-amyrin synthase，αAS)MdOSC1引入釀酒酵母中，通過代謝工程改造增加前體物質(zhì)2,3-氧化鯊烯(2,3-oxidosqualene)的供應(yīng)，α-香樹脂醇的搖瓶產(chǎn)量達到12.0 mg/L。QIAO等[15]將羽扇豆醇合酶(lupeol synthase，LUS)OeLUP在釀酒酵母進行異源表達，實現(xiàn)了羽扇豆醇的生物合成。ZHANG等[16]在釀酒酵母中構(gòu)建了β-香樹脂醇合成途徑，并對其合成途徑進行調(diào)控和發(fā)酵優(yōu)化，β-香樹脂醇產(chǎn)量達138.8 mg/L。在重組釀酒酵母中，五環(huán)三萜化合物是以MVA途徑產(chǎn)生的異戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)為前體，依次在法尼基焦磷酸合酶(ERG20)、鯊烯合酶(ERG9)和鯊烯環(huán)氧酶(ERG1)的催化作用下生成2,3-氧化鯊烯，2,3-氧化鯊烯進一步在α-香樹脂醇合酶、羽扇豆醇合酶和計曼尼醇合酶(germanicol synthase，GES)的作用下生成相應(yīng)的三萜母核[8]。

本研究以KEASLING教授惠贈的高效積累IPP和DMAPP的釀酒酵母菌株JWy601[17]為出發(fā)菌株，運用CRISPR/Cas9技術(shù)[18]，整合長春花來源的α-香樹脂醇合酶，構(gòu)建得到α-香樹脂醇生物合成途徑；異源表達洋甘草來源的羽扇豆醇合酶，獲得產(chǎn)羽扇豆醇釀酒酵母工程菌株；引入羊蹄甲來源的計曼尼醇合酶，實現(xiàn)計曼尼醇的生物合成。進一步通過代謝工程策略過表達MVA代謝途徑中的關(guān)鍵酶ERG1，增加前體物質(zhì)2,3-氧化鯊烯的供應(yīng)，提高五環(huán)三萜的產(chǎn)量。本研究建立了三萜微生物合成平臺，為構(gòu)建五環(huán)三萜酸及其衍生物釀酒酵母細胞工廠奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

實驗所用質(zhì)粒和菌株信息詳見表1。

表1 本研究所用質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.1.2 引物

實驗所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，如表2所示。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。培養(yǎng)大腸桿菌時向培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的Amp或50 μg/mL的Kan。

酵母尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(g/L)：酵母SC-URA培養(yǎng)基7.9，葡萄糖20。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。

YPG培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，半乳糖20。

若需要固體培養(yǎng)基，向上述液體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉。

1.1.4 試劑和儀器

Green Taq Mix、2×Phanta Max Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；酵母基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；Amp、Kan，生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母SC-URA培養(yǎng)基，艾禮生物科技(上海)有限公司；α-香樹脂醇和羽扇豆醇標準品，上海源葉生物科技有限公司；計曼尼醇標準品，云南西力生物技術(shù)股份有限公司。

Bio-Rad C1000 TOUCH型PCR儀，美國伯樂公司；EPS 300型核酸電泳系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；LDZM-80KCS-II型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；CT15RE型高速冷凍離心機，日本日立公司；ZQZY-HC型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Pegasus BT型氣相-高通量飛行時間質(zhì)譜儀，美國力可公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五環(huán)三萜合成途徑的構(gòu)建

本實驗所選取的表達五環(huán)三萜合成途徑相關(guān)酶的編碼基因來源情況如下：α-香樹脂醇合酶編碼基因CrαAS來源于長春花(Catharanthusroseus)，羽扇豆醇合酶編碼基因GgLUS來源于洋甘草(Glycyrrhizaglabra)，計曼尼醇合酶編碼基因BfGES來源于羊蹄甲(Bauhiniaforficata)。以上基因由蘇州金唯智生物科技有限公司按照釀酒酵母密碼子偏好性進行優(yōu)化、合成并克隆至質(zhì)粒pET28a上，得到重組質(zhì)粒：pET28a-CrαAS、pET28a-GgLUS和pET28a-BfGES。在此基礎(chǔ)上，以菌株JWy601基因組為模板，通過表2中所示的引物，分別擴增獲得ERG1、PGAL1、TADH1和不同位點的上下游同源臂片段；以質(zhì)粒pET28a-CrαAS、pET28a-GgLUS和pET28a-BfGES為模板，表2中所示的序列為引物，分別擴增獲得CrαAS、GgLUS和BfGES基因片段；同時，提取pCut-308a和pCut-1622b質(zhì)粒，用于構(gòu)建釀酒酵母五環(huán)三萜合成途徑。

1.2.2 工程菌株的篩選

本研究利用的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)[18]是一個單質(zhì)粒系統(tǒng)，pCut-308a和pCut-1622b質(zhì)粒攜帶有表達Cas9蛋白的基因和靶向相應(yīng)位點的sgRNA，用來進行基因的靶向整合。首先將CrαAS、GgLUS和BfGES基因分別整合至釀酒酵母基因組308a位點，獲得菌株S01、S02和S03；進一步整合ERG1基因至菌株S01、S02和S03的1622b位點，分別獲得菌株S04、S05和S06。具體篩選方法如下：首先通過釀酒酵母醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，分別把1.2.1中得到的基因片段與上下游同源臂、PGAL1、TADH1和pCut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母，利用同源重組機制實現(xiàn)PGAL1-目的基因-TADH1表達盒的組裝；接下來將轉(zhuǎn)化平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出轉(zhuǎn)化子后對其進行PCR驗證，完成第1次篩選；最后對驗證成功的轉(zhuǎn)化子進行傳代培養(yǎng)，待質(zhì)粒成功消除后進行第2次PCR驗證，進一步測序確認最終獲得整合表達氧化鯊烯環(huán)化酶和ERG1的工程菌株。

1.2.3 工程菌株的發(fā)酵

凍管菌經(jīng)YPD平板劃線活化后，接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h；隨后轉(zhuǎn)接至50 mL YPD培養(yǎng)基中，使其初始菌體濃度OD600=0.2，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；然后離心收集菌體，更換50 mL YPG培養(yǎng)基誘導表達，定時取樣,對重組菌生長趨勢、α-香樹脂醇、羽扇豆醇和計曼尼醇產(chǎn)量進行測定。

1.2.4 工程菌株產(chǎn)物的提取

對發(fā)酵過程中的樣品進行快速提取，具體方法如下：取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min室溫離心1 min收集菌體，用等體積20%氫氧化鉀溶液(50%乙醇配制)重懸，沸水浴10 min；加入等體積正己烷萃取3次，離心取上清液；用無水硫酸鈉除水后對樣品進行硅烷化處理，轉(zhuǎn)移至氣相小瓶中用氣相-高通量飛行時間質(zhì)譜儀分析。

1.2.5 產(chǎn)物的分析與檢測

氣相-高通量飛行時間質(zhì)譜儀測定：色譜柱為DB-5MS，載氣氦氣的流速為1.0 mL/min；進樣口溫度300 ℃，分流進樣，進樣量1 μL，分流比10∶1；升溫起始溫度180 ℃，保持1 min，然后以20 ℃/min升至300 ℃，保持14 min；質(zhì)譜掃描為50～600m/z。α-香樹脂醇、羽扇豆醇和計曼尼醇標準品用于定性和定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-香樹脂醇細胞工廠構(gòu)建及產(chǎn)物分析

在釀酒酵母中引入植物來源的α-香樹脂醇合酶可催化2,3-氧化鯊烯生成α-香樹脂醇[14]。本研究選取來源于長春花的α-香樹脂醇合酶CrαAS(GenBank ID:JQ027033.1)用于構(gòu)建α-香樹脂醇細胞工廠。在釀酒酵母JWy601中整合CrαAS基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，PCR產(chǎn)物大小與表達盒理論值大小3 139 bp一致，測序結(jié)果進一步表明，本實驗成功構(gòu)建得到整合有α-香樹脂醇合酶CrαAS的釀酒酵母工程菌株S01。

M-DL 10000 DNA marker；泳道1～4-工程菌株S01驗證圖1 整合α-香樹脂醇合酶編碼基因CrαAS PCR驗證Fig.1 PCR verification of integrating CrαAS gene encoding α-amyrin synthase

工程菌株S01在YPG培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h，利用GC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物進行分析。結(jié)果如圖2-a所示，工程菌株S01發(fā)酵產(chǎn)物在14.24 min時出現(xiàn)與α-香樹脂醇標準品保留時間一致的峰，實現(xiàn)了釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)α-香樹脂醇。工程菌株S01菌體生長曲線和α-香樹脂醇產(chǎn)量變化曲線如圖2-b所示，誘導發(fā)酵48 h時產(chǎn)量最高，達到50.7 mg/L。

2.2 羽扇豆醇細胞工廠構(gòu)建及產(chǎn)物分析

羽扇豆醇合酶可以將2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成羽扇豆烷型三萜母核羽扇豆醇[15]。本研究把洋甘草來源的羽扇豆醇合酶GgLUS(GenBank ID:AB116228.1)整合到釀酒酵母中，用于構(gòu)建生產(chǎn)羽扇豆醇的工程菌株。以釀酒酵母JWy601為出發(fā)菌株，把GgLUS基因整合至其基因組上，PCR驗證結(jié)果如圖3所示，所得條帶大小3 127 bp，與表達盒理論值大小相符，測序結(jié)果也顯示表達盒構(gòu)建成功，獲得表達羽扇豆醇合酶GgLUS的釀酒酵母工程菌株S02。

a-GC-MS檢測的總離子流色譜圖；b-工程菌株S01菌體生長曲線和α-香樹脂醇產(chǎn)量變化曲線圖2 工程菌株S01發(fā)酵生產(chǎn)α-香樹脂醇Fig.2 Production of α-amyrin by engineered strain S01

M-DL 10000 DNA marker；泳道1～4-工程菌株S02驗證圖3 整合羽扇豆醇合酶編碼基因GgLUS PCR驗證Fig.3 PCR verification of integrating GgLUS gene encoding lupeol synthase

對工程菌株S02進行搖瓶發(fā)酵實驗，提取發(fā)酵液樣品，萃取后用GC-MS進行定性和定量分析?？傠x子流色譜圖如圖4-a所示，羽扇豆醇標準品在14.30 min時出峰，工程菌株S02發(fā)酵產(chǎn)物在該時間點也出峰，表明成功構(gòu)建產(chǎn)羽扇豆醇釀酒酵母細胞工廠。工程菌株S02在YPG培養(yǎng)基中誘導表達48 h時，羽扇豆醇產(chǎn)量高達45.8 mg/L(圖4-b)。

2.3 計曼尼醇細胞工廠構(gòu)建及產(chǎn)物分析

齊墩果烷型三萜母核計曼尼醇是以2,3-氧化鯊烯為前體物質(zhì)，在計曼尼醇合酶的作用下環(huán)化而成的[8]。本研究將來源于羊蹄甲的計曼尼醇合酶BfGES(GenBank ID:LC464979.1)在釀酒酵母中異源表達，構(gòu)建計曼尼醇生物合成途徑。把BfGES基因整合至釀酒酵母JWy601底盤細胞中，PCR驗證結(jié)果如圖5所示，所得DNA片段大小與表達盒大小理論值一致(3 148 bp)，進一步測序確認計曼尼醇合成途徑構(gòu)建成功，獲得釀酒酵母工程菌株S03。

a-GC-MS檢測的總離子流色譜圖；b-工程菌株S02菌體生長曲線和羽扇豆醇產(chǎn)量變化曲線圖4 工程菌株S02發(fā)酵生產(chǎn)羽扇豆醇Fig.4 Production of lupeol by engineered strain S02

M-DL 10000 DNA marker；泳道1～4-工程菌株S03驗證圖5 整合計曼尼醇合酶編碼基因BfGES PCR驗證Fig.5 PCR verification of integrating BfGES gene encoding germanicol synthase

工程菌株S03在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，更換YPG培養(yǎng)基進行誘導表達，提取發(fā)酵液樣品，用GC-MS對其進行檢測。產(chǎn)物檢測結(jié)果如圖6-a所示，在14.36 min時，計曼尼醇標準品和工程菌株S03發(fā)酵產(chǎn)物均出峰，表明產(chǎn)計曼尼醇釀酒酵母工程菌株構(gòu)建成功。由工程菌株S03菌體生長曲線和計曼尼醇產(chǎn)量變化曲線圖(圖6-b)可以看出，計曼尼醇產(chǎn)量先快速升高，后緩慢下降，在誘導48 h 時達到最高17.6 mg/L。

a-GC-MS檢測的總離子流色譜圖；b-工程菌株S03菌體生長曲線和計曼尼醇產(chǎn)量變化曲線圖6 工程菌株S03發(fā)酵生產(chǎn)計曼尼醇Fig.6 Production of germanicol by engineered strain S03

2.4 過表達ERG1基因?qū)︶劸平湍肝瀛h(huán)三萜產(chǎn)量的影響

MVA途徑作為細胞中乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為萜類化合物的第1個關(guān)鍵模塊，其活性會直接影響到細胞中萜類產(chǎn)量，其中，ERG1是釀酒酵母MVA代謝途徑中的關(guān)鍵酶。ERG1基因編碼鯊烯環(huán)氧酶，其作用是把鯊烯氧化生成2,3-氧化鯊烯。張學禮等[19]用同源重組的方法過表達ERG1基因，提高了釀酒酵母工程菌株中達瑪二烯和原人參二醇的產(chǎn)量。

因此，為進一步提高本研究構(gòu)建得到的釀酒酵母工程菌株產(chǎn)五環(huán)三萜能力，本研究在先前工作的基礎(chǔ)上，通過代謝工程策略對菌株S01、S02和S03進行了改造。即在菌株S01、S02和S03中過表達ERG1基因，分別得到菌株S04、S05和S06。工程菌株在YPG培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，結(jié)果如圖7所示，菌株S04中α-香樹脂醇的產(chǎn)量為96.3 mg/L，是菌株S01的1.9倍；菌株S05中羽扇豆醇的產(chǎn)量達到91.6 mg/L，是菌株S02的2倍；菌株S06中計曼尼醇產(chǎn)量達到了38.7 mg/L，是菌株S03的2.2倍。研究結(jié)果表明增加前體物質(zhì)的供應(yīng)可顯著增強工程菌株五環(huán)三萜的生產(chǎn)能力。本研究獲得的菌株S04中α-香樹脂醇的產(chǎn)量和菌株S05中羽扇豆醇的產(chǎn)量與已有報道水平相當，菌株S06中計曼尼醇產(chǎn)量是已報道的4.7倍，后續(xù)會開展合成途徑與發(fā)酵工藝優(yōu)化工作提高五環(huán)三萜的產(chǎn)量。

圖7 過表達ERG1基因提高五環(huán)三萜的產(chǎn)量Fig.7 Enhanced production of pentacyclic triterpenoids by overexpressing ERG1 gene

3 討論

目前三萜類化合物的合成主要是通過植物提取，成本高效率低，本研究以安全的真核模式微生物釀酒酵母為底盤細胞，分別整合不同來源的氧化鯊烯環(huán)化酶并利用代謝工程策略提高其產(chǎn)量，構(gòu)建產(chǎn)五環(huán)三萜的微生物細胞工廠。本研究獲得的工程菌株S04 α-香樹脂醇產(chǎn)量達到96.3 mg/L，α-香樹脂醇是烏蘇烷型三萜的前體，在氧化還原反應(yīng)、?；⑻腔刃揎椬饔孟?，能形成結(jié)構(gòu)和功能各異的烏蘇烷三萜，其C-28位連續(xù)氧化產(chǎn)物熊果酸有抗癌、抗糖尿病及抗?jié)兘笛淖饔肹20]。工程菌株S05羽扇豆醇產(chǎn)量可達91.6 mg/L，羽扇豆醇屬于羽扇豆烷型三萜化合物，其衍生物白樺脂酸被認為是很有前景的抗腫瘤及抗艾滋病病毒的候選藥物[21]。工程菌株S06可生產(chǎn)38.7 mg/L計曼尼醇，計曼尼醇屬于齊墩果烷型三萜，齊墩果烷型三萜化合物具有廣泛的藥理活性，齊墩果酸[20]和甘草酸類[22]藥物制劑已在臨床應(yīng)用于肝臟保護。隨著三萜類化合物合成途徑的解析，后續(xù)研究可在產(chǎn)五環(huán)三萜骨架釀酒酵母合成途徑與發(fā)酵工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進一步整合氧化三萜骨架的細胞色素P450氧化酶[23-25]，用于生產(chǎn)活性更高的三萜化合物。本研究建立了三萜微生物合成平臺，為構(gòu)建五環(huán)三萜酸及其衍生物釀酒酵母細胞工廠奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。