劉曉霞，曹婷婷，李沛軒，張睿，劉麗萍，王雪艷，王雯慧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

黏膜不僅是機(jī)體內(nèi)外環(huán)境直接交流的場(chǎng)所，也是機(jī)體抵御外界病原微生物的主要屏障。機(jī)體絕大部分的感染都是經(jīng)黏膜入侵引起的，而胃腸道黏膜被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)最大的免疫器官，每天接觸大量的外來(lái)抗原，要想識(shí)別并清除這些外來(lái)成分，就需要黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮相關(guān)功能，維持胃腸道的動(dòng)態(tài)平衡。其中，IgM作為黏膜抗體對(duì)胃腸道黏膜免疫有著重要作用，它是抵御外源性抗原的第一道防線。

IgM是唯一一種所有脊椎動(dòng)物中都存在的抗體類別[1]，由漿細(xì)胞產(chǎn)生并釋放，主要以分泌型IgM(sIgM)的形式混入黏膜分泌物中，發(fā)揮免疫學(xué)作用。sIgM有多種免疫效應(yīng)功能[2-4]，與IgA和IgG相比，能有效地激活補(bǔ)體，發(fā)揮補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)，同時(shí)釋放細(xì)胞因子、趨化因子或炎癥介質(zhì)，通過(guò)與其Fc受體(Fcα/μR和FcμR)的相互作用，參與內(nèi)吞、介導(dǎo)抗感染免疫。IgM在IgA缺乏時(shí)也可以代替其成為黏膜免疫系統(tǒng)的主導(dǎo)性抗體，研究表明，在患有選擇性IgA缺陷的人群中，約有一半的人沒(méi)有癥狀，就是因?yàn)槲改c道黏膜中SIgM的釋放增加了[5]。此外，IgM在抗癌免疫反應(yīng)中也有一定作用，能夠有效抑制癌瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)殺傷癌瘤細(xì)胞，如天然IgM能將捕獲的病毒顆粒運(yùn)送到次級(jí)淋巴器官，從而加強(qiáng)獲得性免疫應(yīng)答的速度和強(qiáng)度[6]。

IgM類抗體也可以作為一種診斷工具，用來(lái)判斷機(jī)體是否存在近期感染，對(duì)感染監(jiān)測(cè)以及高發(fā)地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。例如在這次波及全球的新冠疫情中，就將病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽(yáng)性作為確診標(biāo)準(zhǔn)之一，尤其是通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)IgM適用于新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)檢測(cè)的各個(gè)階段[7]。另外，高滴度抗體血漿也被應(yīng)用于治療重癥SARS-CoV-2患者[8]。IgM抗體已經(jīng)在多個(gè)方面發(fā)揮出了自己獨(dú)特的作用，受到了越來(lái)越多的人重視。

目前在動(dòng)物上針對(duì)IgM的研究集中于外源性物質(zhì)(飼料、藥物、細(xì)菌等)以及各種疾病對(duì)其表達(dá)和分布的影響，例如，楊紅洋等[9]對(duì)雞免疫新城疫疫苗后，探究中藥復(fù)方多糖對(duì)雞血清中IgM含量的影響；王曉珊[10]研究中藥復(fù)方“紫黃散”對(duì)新城疫病毒(NDV)感染雞后免疫球蛋白含量及黏膜免疫組織淋巴細(xì)胞數(shù)量的改變。而關(guān)于正常動(dòng)物IgM分泌細(xì)胞的研究相對(duì)較少，尤其針對(duì)家兔胃腸道的更為少見(jiàn)。本試驗(yàn)以家兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究IgM分泌細(xì)胞在不同年齡家兔胃腸道黏膜的分布，以期為防治家兔胃腸道疾病及新型口服疫苗的開(kāi)發(fā)等提供一些免疫學(xué)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只日本大耳兔購(gòu)于蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，將30只日本大耳兔分為3組，即幼年組(2月齡)、青年組(5～7月齡)、老年組(36月齡)，每組10只，雌雄各半。

1.2 主要試劑和儀器

山羊抗兔IgM多克隆抗體(一抗)，購(gòu)于Abcam公司；生物素標(biāo)記驢抗山羊IgG多克隆抗體(二抗)，購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；濃縮型DAB試劑盒，購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；切片機(jī)，購(gòu)于德國(guó)Leica公司；DP-71顯微照相系統(tǒng)，購(gòu)于日本Olympus公司。

1.3 樣品的采集和制備

1.3.1 組織樣品制備

耳緣靜注戊巴比妥鈉(0.1 mL/kg)致死家兔，打開(kāi)腹腔采集胃底腺區(qū)、幽門(mén)腺區(qū)、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸等部位組織樣品，并立即用10%中性福爾馬林溶液固定樣品。

1.3.2 切片制作

將固定好的樣品按部位取材，胃組織樣品大小約為1 cm×1 cm×0.4 cm，腸道組織樣品長(zhǎng)約為0.5 cm，流水過(guò)夜后將組織塊分別置于75%、80%、95%、100%梯度酒精中脫水，按常規(guī)方法制作石蠟切片，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組化染色

采用間接ABC免疫組織化學(xué)染色法。脫蠟至水洗；3% H2O2溶液室溫作用15 min，純水洗2 min×3次；37℃，0.1%胰蛋白酶作用40 min，純水洗2 min×3次；37 ℃，5% BSA封閉40 min；滴加一抗(1∶500)4 ℃孵育18 h(不超過(guò)24 h)，PBS洗5 min×4次；滴加二抗(1∶1 000)37 ℃孵育40 min，PBS洗5 min×4次；室溫避光進(jìn)行DAB顯色；蘇木精輕度復(fù)染。之后進(jìn)行脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡觀察。陰性對(duì)照組除用PBS代替一抗孵育外，其余步驟與試驗(yàn)組一致。

1.5 組織學(xué)觀察及數(shù)據(jù)處理

每份樣品切片隨機(jī)選擇5張，使用Olympus DP-71顯微鏡觀察切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性IgM分泌細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞數(shù)量以平均每高倍視野細(xì)胞個(gè)數(shù)(個(gè)/HPF)來(lái)表示。使用IBM SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，并分別進(jìn)行組內(nèi)比較(單因素方差分析)和組間比較(獨(dú)立性t檢驗(yàn))，采用ORIGINPRO2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃中IgM分泌細(xì)胞的分布特點(diǎn)

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，未加一抗的胃底腺區(qū)(圖1A)和幽門(mén)腺區(qū)(1D)染色陰性；呈陽(yáng)性的IgM分泌細(xì)胞大多為圓形或橢圓形，細(xì)胞核呈圓形，位于細(xì)胞的一端，有的則在細(xì)胞中央，少數(shù)核有凹陷，且核不著色，陽(yáng)性細(xì)胞為明顯的胞漿染色，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)可初步判斷IgM分泌細(xì)胞為漿細(xì)胞。IgM分泌細(xì)胞在青年組家兔胃底腺區(qū)和幽門(mén)腺區(qū)的分布略有不同，在胃底腺區(qū)中散在分布于胃黏膜固有層(圖1B和1C)，而在幽門(mén)腺區(qū)中則主要集中在腺體周圍的固有層，少數(shù)存在于胃小凹周圍的黏膜固有層(圖1E和1F)。幼年組和老年組家兔胃中IgM分泌細(xì)胞的分布規(guī)律與青年組相似。

A.胃底腺區(qū)陰性對(duì)照；B.胃底腺區(qū)；C. 胃底腺區(qū)局部放大；D.幽門(mén)腺區(qū)陰性對(duì)照；E.幽門(mén)腺區(qū)；F. 幽門(mén)腺區(qū)局部放大。箭頭所示為IgM分泌細(xì)胞

2.2 腸道中IgM分泌細(xì)胞的分布特點(diǎn)

腸道內(nèi)呈陽(yáng)性的IgM分泌細(xì)胞也是胞漿明顯著色(圖2)，與胃中的結(jié)構(gòu)相似。染色結(jié)果顯示，IgM分泌細(xì)胞在各年齡組腸道中的分布位置相似，但存在數(shù)量上的區(qū)別，以青年組為例，IgM分泌細(xì)胞在其各腸段均有分布，但分布位置有所差異。在十二指腸中，IgM分泌細(xì)胞主要分布在絨毛固有層和絨毛基部固有層，十二指腸腺周圍的黏膜下次也有較多分布，但絨毛頂部固有層分布較少(圖2B)；空腸和回腸中的IgM分泌細(xì)胞分布較為相似，主要分布在絨毛基部固有層，絨毛固有層存在較少(圖2E、圖2H)；而在大腸(盲腸、結(jié)腸、直腸)中，IgM分泌細(xì)胞主要存在大腸腺周圍的固有層中，其次在絨毛基部固有層也有所分布，絨毛固有層中幾乎沒(méi)有(圖3)。

A.十二指腸陰性對(duì)照；B.十二指腸；C. 十二指腸局部放大；D.空腸陰性對(duì)照；E.空腸；F. 空腸局部放大；G.回腸陰性對(duì)照；H.回腸；I. 回腸局部放大。箭頭所示為IgM分泌細(xì)胞

A.盲腸陰性對(duì)照；B.盲腸；C. 盲腸局部放大；D.結(jié)腸陰性對(duì)照；E.結(jié)腸；F. 結(jié)腸局部放大；G.直腸陰性對(duì)照；H.直腸；I. 直腸局部放大。箭頭所示為IgM分泌細(xì)胞

2.3 各年齡段胃腸道不同部位中 IgM分泌細(xì)胞的分布密度變化

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示，各年齡組IgM分泌細(xì)胞在胃腸道呈先增加后減少的趨勢(shì)，青年組十二指腸中的分布密度最高，老年組直腸中的分布密度最低。在胃部(圖4A)，各年齡組IgM分泌細(xì)胞主要分布于幽門(mén)腺區(qū)，密度極顯著高于胃底腺區(qū)(P<0.01)。小腸中(圖4B)，幼年組和青年組在十二指腸的密度均極顯著高于空腸和回腸(P<0.01)，幼年組空腸分布密度和回腸相近(P>0.05)，青年組和老年組在空腸的密度均顯著高于回腸(P<0.05)。大腸中(圖4 C)，青年組盲腸分別極顯著高于結(jié)腸和直腸(P<0.01)。IgM分泌細(xì)胞在家兔胃腸中的分布密度隨年齡增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，青年期達(dá)到頂峰，隨后逐漸下降。統(tǒng)計(jì)顯示，幼年組在胃底腺部(P<0.05)、空腸(P<0.01)、回腸(P<0.01)的分布密度低于青年組；老年組在幽門(mén)腺區(qū)(P<0.01)、十二指腸(P<0.01)、空腸(P<0.01)、回腸(P<0.05)、盲腸(P<0.01)、結(jié)腸(P<0.05)的分布密度均低于青年組。

相同部位組間標(biāo)注*為P<0.05，**為P<0.01；相同年齡組不同部位標(biāo)注大寫(xiě)字母不同表示P<0.01，不同小寫(xiě)字母表示P<0.05，字母相同表示P>0.05

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，家兔胃腸道IgM分泌細(xì)胞主要分布在黏膜固有層、腸絨毛固有層、絨毛基部固有層以及腸腺附近。胃部結(jié)果分析可知，各年齡組胃底腺區(qū)IgM分泌細(xì)胞的密度明顯低于幽門(mén)腺區(qū)，這可能因?yàn)槲傅紫賲^(qū)的分泌細(xì)胞主要是壁細(xì)胞、主細(xì)胞、頸黏液細(xì)胞，這些細(xì)胞的分泌物形成了胃底腺區(qū)的強(qiáng)酸性環(huán)境，使大部分外來(lái)病原微生物難以存活，這些因素分擔(dān)了免疫細(xì)胞的部分責(zé)任，因此胃底腺區(qū)所需的免疫細(xì)胞會(huì)相應(yīng)較少。此外還發(fā)現(xiàn)， IgM分泌細(xì)胞在胃的分布密度不及腸道，這可能是由于家兔為單室胃，物質(zhì)交換的較少，外來(lái)抗原侵入的機(jī)會(huì)也相對(duì)較少。

小腸中IgM分泌細(xì)胞的分布密度變化則是十二指腸、空腸、回腸依次減少，車傳燕等[11]在斷奶仔豬小腸中也發(fā)現(xiàn)IgG分泌細(xì)胞在十二指腸的數(shù)量極高，顯著高于空腸，極顯著高于回腸。Allen等[12]研究仔豬小腸中IgM分泌細(xì)胞的分布規(guī)律后，也得出了相似結(jié)論。而出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因很有可能是因?yàn)轭B強(qiáng)的外來(lái)微生物在逃過(guò)胃的防御機(jī)制后，首先經(jīng)過(guò)十二指腸，該部位腸黏膜內(nèi)外的物質(zhì)交換非常頻繁，受到各種抗原的不斷刺激，承擔(dān)的免疫壓力最大，且大量進(jìn)入腸道的外源性抗原以及消化液等物質(zhì)會(huì)刺激免疫細(xì)胞的發(fā)育和成熟[13-14]。因而，此處最有可能發(fā)生體液免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)效應(yīng)B細(xì)胞前體細(xì)胞發(fā)育成IgM分泌細(xì)胞，以產(chǎn)生更多的sIgM抵抗外源性抗原的入侵。隨著腸內(nèi)容物后移，大部分抗原通過(guò)各種途徑被清除掉，因此，到達(dá)空腸后段乃至回腸時(shí)，IgM分泌細(xì)胞數(shù)量顯著減少，這說(shuō)明小腸前段可能是發(fā)揮免疫功能的主要部位。

大腸作為消化道的后段，能對(duì)前段消化道中未吸收的物質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)償吸收。家兔是草食性單胃動(dòng)物，主要通過(guò)大腸微生物發(fā)酵來(lái)吸收纖維素，大量細(xì)菌會(huì)在此處繁殖。試驗(yàn)結(jié)果表明，IgM分泌細(xì)胞在大腸中主要分布于盲腸，這可能與家兔盲腸特殊的生理結(jié)構(gòu)有關(guān)，盲腸固有層中豐富的孤立淋巴小結(jié)和彌散淋巴細(xì)胞為IgM分泌細(xì)胞的發(fā)育提供了充足來(lái)源，家兔發(fā)達(dá)的盲腸，功能與反芻動(dòng)物的瘤胃相似，主要進(jìn)行微生物消化，食物殘?jiān)诖颂幫Ａ舻臅r(shí)間較長(zhǎng)，盲腸復(fù)雜的微生物環(huán)境使它擁有比結(jié)腸和直腸更加強(qiáng)有力的免疫能力，以便應(yīng)對(duì)隨時(shí)發(fā)生的免疫應(yīng)答。田波等[15]對(duì)牦牛黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞在大腸各段的分布研究結(jié)果顯示，漿細(xì)胞在盲腸中分布最多，直腸最少，主要存在固有層腸腺之間，與本試驗(yàn)結(jié)果高度相似。

此外，對(duì)不同年齡組同一腸段IgM分泌細(xì)胞的密度進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，青年組數(shù)量明顯多于幼年組和老年組，其隨年齡呈下降趨勢(shì)，這可能與生理特性以及發(fā)育水平有關(guān)。Zhang等[16]研究不同年齡雙峰駝小腸中IgA和IgG分泌細(xì)胞的分布時(shí)發(fā)現(xiàn)，這兩種細(xì)胞密度從幼齡到青年呈上升趨勢(shì)，在青年達(dá)到峰值，然后隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸下降。據(jù)研究，老年動(dòng)物淋巴濾泡中B淋巴細(xì)胞的分化、增殖和成熟都會(huì)受到抑制，從而導(dǎo)致外周血中的漿細(xì)胞數(shù)量減少[17]，而IgA分泌細(xì)胞可以通過(guò)腸道歸巢分子的作用，從外周血中歸巢到腸道固有層[18]，外周血中的漿細(xì)胞數(shù)量的減少，可能會(huì)相應(yīng)引起腸道中抗體分泌細(xì)胞的減少。但也有一些免疫細(xì)胞沒(méi)有這種變化趨勢(shì)，隨著年齡的增長(zhǎng)其分布密度反而升高，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)和輔助性T細(xì)胞(helper T lymphocyte，Th)數(shù)量隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[19]。Stervbo等[20]對(duì)24名青年人(19～30歲)和26名老年人(53～67歲)的外周血中的免疫細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，中間型單核細(xì)胞(CD14+ +CD16+)和非經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14+CD16+ +)在老年人中較年輕人多。由此可發(fā)現(xiàn)衰老會(huì)顯著降低IgM分泌細(xì)胞在健康家兔胃腸道的分布密度，但不會(huì)改變其分布位置，在其他種屬動(dòng)物的胃腸道中IgM分泌細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞也具有類似的分布模式。