閆富龍，祝宇龍，彭燦，2，3，4*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 23002；2.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 23002；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 23002；4.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，合肥 23002）

近年來，隨著對(duì)藥物研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)在藥物的藥物成分、手性、結(jié)構(gòu)、純度等因素固定時(shí)，藥物在質(zhì)量和療效上仍然存在著不穩(wěn)定現(xiàn)象。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)了多晶型這一重要影響因素[1]。多晶型現(xiàn)象是指固體藥物在結(jié)晶過程中因?yàn)闂l件的差異，分子在晶胞中對(duì)稱規(guī)律的不同，使得藥物分子之間、藥物分子與溶劑分子之間相互作用力或結(jié)合方式以及空間結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化，從而使藥物晶體出現(xiàn)兩種或兩種以上的空間群和晶胞參數(shù)[2-4]。不同的晶型具有不同的機(jī)械學(xué)、熱力學(xué)、物理學(xué)和化學(xué)特性，尤其是對(duì)難溶性藥物來說，不同晶型的轉(zhuǎn)變會(huì)影響其在體內(nèi)的溶解和吸收，進(jìn)而影響藥物的生物利用度、療效，甚至產(chǎn)生不良反應(yīng)，影響用藥安全[5-7]。我國是一個(gè)仿制藥大國，并且仿制企業(yè)繁多，同一品種可能被多家企業(yè)仿制，而藥物的多晶型會(huì)直接影響藥品的有效性、安全性和質(zhì)量[8]。因此，固體藥物多晶型的研究對(duì)藥物的開發(fā)上市至關(guān)重要。

鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride）是一種天然異喹啉類生物堿，又稱為黃連素，主要來源于黃連、黃柏、三顆針等小檗科等4 科10 屬藥用植物[9-11]。目前鹽酸小檗堿可以由植物提取和人工合成兩種途徑獲得[12]，在臨床上常用于治療細(xì)菌性瘧疾、腸胃炎等疾病[13-14]，效果顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，其還有降血脂[15]、降血糖[16]、抗腫瘤[17-19]和抗心律失常[20]等藥理作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前國內(nèi)外對(duì)于鹽酸小檗堿片劑的研究，大部分集中于質(zhì)檢分析、含量測(cè)定以及輔料對(duì)鹽酸小檗堿溶出度的影響等方面，而對(duì)其晶型的研究很少[21-23]。羅小飛等[24]發(fā)現(xiàn)不同溶劑中析出的鹽酸小檗堿溶解度不同，經(jīng)X 衍射分析發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿也存在多種晶型現(xiàn)象。晶型研究對(duì)于鹽酸小檗堿藥效發(fā)揮尤為重要，本文應(yīng)用單一溶劑重結(jié)晶法制備鹽酸小檗堿不同晶型，比較不同晶型自制片在不同溶出介質(zhì)中的溶出行為，為改善鹽酸小檗堿溶出與藥物臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

鹽酸小檗堿對(duì)照品（含量：86.8%，批號(hào)：160901，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（北京百靈威科技有限公司）；冰醋酸、鹽酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸鹽（天津市福晨試劑公司）；三乙胺（批號(hào)：20191130，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水。淀粉（批號(hào)：S116028）、羧甲基淀粉鈉（CMS-Na，批號(hào)：C105666，阿拉丁有限公司）；聚維酮 K30（PVP K30，批號(hào)：190506，安徽山河藥用輔料股份有限公司）；聚山梨酯 80（薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司），硬脂酸鎂（遼寧奧達(dá)制藥有限公司）。所有輔料均為藥用級(jí)輔料。

1.2 儀器

SmartLab3KW X-射線衍射儀（日本理學(xué)公司）；S-3700N 掃描電子顯微鏡（日本島津公司）；Spectrum 400 紅外光譜儀（英國PE 公司）；Mettler TGA/DSC1 熱分析儀（瑞士梅特勒公司）；高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（YL060S，濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司）；超純水機(jī)（milli-Q Synt hesis，millipore）；十萬分之一電子天平（BT25S，墨多利斯科學(xué)儀器有限公司）；循環(huán)水式真空泵；溶出試驗(yàn)儀（ZRS-8L，天津天大天發(fā)科技有限公司）；ZP29 旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)（上海天峰）；YD-1 片劑硬度測(cè)試儀（天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 晶型樣品制備

本研究采用單一溶劑重結(jié)晶法制備鹽酸小檗堿晶型樣品，鹽酸小檗堿原料藥晶型設(shè)為晶A 型，其他新制備得到的晶型依次命名為晶B 型至晶F 型。取鹽酸小檗堿原料藥300 mg 于潔凈容器中，少量多次加入總量為40 mL 的醋酸溶液、或100 mL 的乙酸乙酯溶液、或總量為25 mL 的二氯甲烷溶液、或總量為80 mL 的乙腈溶液、或總量為100 mL 的丙酮溶液，加熱，體系溫度均為20～100℃，磁力攪拌（速度控制在500～1200 r·min－1），反應(yīng)1～5 h，使其完全溶解，得到黃色澄清溶液。溶液趁熱過濾，濾液置于40～60℃真空干燥環(huán)境下?lián)]發(fā)結(jié)晶，獲得淡黃色粉末分別為鹽酸小檗堿晶B型、鹽酸小檗堿晶C 型、鹽酸小檗堿晶D 型、鹽酸小檗堿晶E 型、鹽酸小檗堿晶F 型。

2.2 鹽酸小檗堿不同晶型表征分析

2.2.1 晶體粉末掃描電子顯微鏡法 使用碳雙面膠帶將樣品固定在黃銅樁上。然后設(shè)置電壓為15 kV，電流為119 μA，拍攝不同晶型粉末微觀照片。

如圖1所示，5 種不同晶型的鹽酸小檗堿粉末呈現(xiàn)不同的微觀形狀。晶B 型和晶F 型呈現(xiàn)兩端漸變鋒利趨勢(shì)的針狀，晶F 型呈現(xiàn)相比于普通針狀更加狹長纖細(xì)的狹長針狀；晶E 型為不規(guī)則塊狀晶型，晶體兩端邊緣無明顯漸變鋒利趨勢(shì)，比較光滑；晶C 型為較為明顯的柱狀晶型，比表面積較大；晶D 型呈現(xiàn)為片狀晶體，與晶C 型柱狀晶型較為相似，但側(cè)面可以看出特別薄，其比表面積比柱狀小。

圖1 鹽酸小檗堿晶5 種晶型的掃描電子顯微鏡圖Fig 1 SEM image of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.2 差示掃描量熱法（DSC） 精密稱取不同晶型鹽酸小檗堿粉末樣品5～10 mg，置于40 μL 標(biāo)準(zhǔn)Al2O3坩堝中，鋪勻后壓蓋，放入差示掃描量熱儀中，以40 μL 標(biāo)準(zhǔn)Al2O3空坩堝為參比，在溫度范圍0～240℃，升溫速率10 ℃·min－1的條件下進(jìn)行分析，記錄DSC 曲線。

如圖2所示，樣品在二次升溫過程中無特征吸收峰，經(jīng)觀察樣品升溫到240℃和300℃時(shí)均已完全碳化，所以185℃左右為鹽酸小檗堿粉末的熔點(diǎn)溫度，與相關(guān)文獻(xiàn)記載的190℃相符。除熔點(diǎn)吸收峰外，晶B 型和晶C 型DSC 圖譜中只存在100℃左右的吸收峰，說明該晶型鹽酸小檗堿粉末中只存在游離水；晶B 型和晶C 型DSC 圖譜中只存在150℃左右的吸收峰，說明該晶型鹽酸小檗堿粉末中只存在結(jié)合水；晶F 型在圖譜上存在100℃左右和150℃左右兩個(gè)特征吸收峰，說明多晶型鹽酸小檗堿粉末中存在游離水和結(jié)晶水。由于制備的鹽酸小檗堿粉末在實(shí)驗(yàn)前已干燥5 h，說明該晶型粉末具有較強(qiáng)的吸濕性。

圖2 鹽酸小檗堿5 種晶型的DSC 圖譜Fig 2 DSC spectrum of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.3 傅里葉變換紅外光譜法 壓力作用因素可能會(huì)導(dǎo)致藥物晶型發(fā)生改變，本實(shí)驗(yàn)采用衰減全反射法（ATR）紅外光譜法，藥物粉末直接進(jìn)樣。光譜范圍：6000～650 cm－1，分辨率：4.00 cm－1，掃描次數(shù)：16 次。

采用紅外光譜法對(duì)5 種晶型鹽酸小檗堿樣品進(jìn)行表征，其紅外吸收光譜如圖3所示。5 種晶型在3649、3324、3047、2162、1505、1140、1109、1066、1018 cm－1等處均具有紅外光譜特征峰，其中紅外光譜特征峰的允許偏差為±2 cm－1。比較鹽酸小檗堿不同晶型樣品紅外吸收峰發(fā)現(xiàn)，晶C型、晶D 型、晶E 型和晶F 型在3549 cm－1處無明顯吸收峰，表明可能發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)；晶B 型和晶C 型在1705 cm－1處存在吸收峰，表明存在羧基，可能來源于醋酸的羧基或乙酸乙酯的酯基。

圖3 鹽酸小檗堿5 種晶型的紅外圖譜Fig 3 Infrared spectrum of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.4 X 射線粉末衍射法 稱取一定量的5 種晶型樣品，進(jìn)行粉末X 射線衍射檢測(cè)。檢測(cè)條件：使用CuKα輻射在40 mA 和40 kV 下運(yùn)行，并在衍射束上配備石墨單色儀，以收集X 射線衍射圖案；在3°≤2θ≤80°的范圍內(nèi)以步長0.01°記錄XRD 圖案，每步至少采集1000 個(gè)計(jì)數(shù)。平均晶體尺寸通過Scherrer 方程估算，其中積分寬度已針對(duì)儀器加寬進(jìn)行了校正。儀器輪廓加寬源自對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品獲得的XRD 數(shù)據(jù)的擬合。

結(jié)果如圖4所示，鹽酸小檗堿5 種晶型在X射線粉末衍射圖譜上均有一定的差異。晶B 型鹽酸小檗堿在2θ＝8.92 處出現(xiàn)了強(qiáng)衍射峰，且強(qiáng)度較高，并在2θ＝47.3 處出現(xiàn)了為其他晶型所不具有的散射峰。晶C 型鹽酸小檗堿在2θ在8～10范圍內(nèi)出現(xiàn)了雙強(qiáng)峰，晶D 型鹽酸小檗堿粉末在2θ為25.4、26.3 時(shí)無明顯散射峰，而在2θ為16.9、17.7 時(shí)處存在散射峰，表明晶D 型可能發(fā)生了鍵位變化或晶型變化。晶E 型鹽酸小檗堿在為2θ為10.1、11.3、11.8 處存在散射，說明晶E 型與其他晶型晶相不同，而晶F 型鹽酸小檗堿13.0～15.0內(nèi)沒有出現(xiàn)衍射峰這與其他晶型不相同。X 射線衍射結(jié)果說明5 種鹽酸小檗堿晶型各不相同。粉末X 射線衍射分析法可用于不用晶型物質(zhì)鑒別，是鹽酸小檗堿晶型鑒定的有效分析方法。

2.3 鹽酸小檗堿片劑制備

本實(shí)驗(yàn)采用濕法制粒法，先將5 g 不同晶型鹽酸小檗堿粉末過100 目篩，置于研缽中，分別加入2.2 g 淀粉和3.55 g 含有聚山梨酯80 的80%乙醇溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆蛑?，制軟材，過80目篩，放置托盤中，105℃下干燥2 h，最后加入70 mg 羧甲基淀粉鈉和50 mg 硬脂酸鎂，混勻，隨之壓片（鹽酸小檗堿自制片規(guī)格為0.1 g/片）。然后對(duì)鹽酸小檗堿自制片進(jìn)行了片劑質(zhì)量檢查，包括片劑外觀、片重差異和片劑硬度等檢查。

從5 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機(jī)選擇6 片進(jìn)行觀察，外觀檢查結(jié)果如表1所示。片劑表面略有黑點(diǎn)出現(xiàn)，經(jīng)過分析，確定黑點(diǎn)是由輔料顏色加深造成的，這對(duì)片劑質(zhì)量沒有影響。由于晶E 型粉末在壓縮時(shí)容易折斷，難以制成片劑，可能與晶E 型的不規(guī)則塊狀有關(guān)。所以后續(xù)研究中，晶E 型將不再納入研究范圍。從4 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機(jī)選擇20 片進(jìn)行準(zhǔn)確稱重，計(jì)算差異。鹽酸小檗堿粉末自制片片重差異見表2，差異范圍在90%～120%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。從4 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機(jī)選擇6 片，用片劑硬度計(jì)測(cè)定片劑硬度，結(jié)果如表3所示，各片劑平均硬度在30～60 N，符合片劑標(biāo)準(zhǔn)。綜合所上，晶E 型鹽酸小檗堿粉末不符合壓片要求，其他4 種晶型粉末所制片劑均符合標(biāo)準(zhǔn)。

表1 5 種晶型鹽酸小檗堿自制片劑外觀檢查(n ＝6)Tab 1 Appearance of 5 crystal forms of berberine hydrochloride tablets (n ＝6)

表2 4 種晶型鹽酸小檗堿自制片片重差異(n ＝6)Tab 2 Weight of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets(n ＝6)

表3 4 種晶型鹽酸小檗堿自制片硬度測(cè)試(n ＝6)Tab 3 Hardness test of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets (n ＝6)

2.4 高效液相法測(cè)定溶出度

采用HPLC 系統(tǒng)，色譜柱為Unitary C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為36 ℃。流動(dòng)相為0.2%三乙胺的0.02 mol·L－1磷酸溶液-乙腈（65∶35，V/V），以1.0 mL·min－1的流速進(jìn)行洗脫。檢測(cè)波長為346 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

取鹽酸小檗堿對(duì)照品用甲醇溶液稀釋至1 mg·mL－1作為對(duì)照品儲(chǔ)備液在4 ℃下保存。取對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋（5～100 μg·mL－1）后測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y＝44.03X＋9.982，R2＝0.999。

同時(shí)，基于課題組前期的研究[25]，考察所建立HPLC 方法的方法學(xué)，包括特異性、線性、精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性和加樣回收率，結(jié)果均符合要求。

2.5 藥物溶出度實(shí)驗(yàn)

分別取鹽酸小檗堿自制片各6 片，以超純水，pH 4.5 醋酸緩沖液，pH 6.8 磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，參照2015年版《中國藥典》鹽酸小檗堿片溶出度測(cè)定法（籃法）進(jìn)行考察。溶出介質(zhì)為1000 mL，轉(zhuǎn)速為120 r·min－1，溫度設(shè)置為（37±2）℃，分別在第5、10、15、20、30、45、60、120 min 取樣，用微孔濾膜過濾后，進(jìn)樣。依據(jù)CFDA 頒布的《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》，連續(xù)兩點(diǎn)溶出量均達(dá)85%以上，且差值在5%以內(nèi)，可作為考察截止時(shí)間點(diǎn)選擇的依據(jù)。從圖5a 中可以看出，在純水溶出介質(zhì)中，晶F 型鹽酸小檗堿自制片較快溶解，能有良好的溶出行為；晶D 型自制片在90 min 內(nèi)累計(jì)溶出量達(dá)到85%，晶B 型和晶C 型自制片在此溶出介質(zhì)中溶出較慢。4 種自制片劑在醋酸緩沖液溶出介質(zhì)的溶出曲線如圖5b 所示，晶B 型、晶D 型和晶F 型自制片能在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到85%溶出量，表現(xiàn)出良好的溶出行為，而晶C型自制片溶出較慢。如圖5c 所示，晶D 型和晶F 型在磷酸緩沖液溶出較快，具有良好的溶出行為；晶B 型和晶C 型自制片在此溶出介質(zhì)中溶出較慢；此外，晶D 型自制片溶出曲線在20～60 min 有一定的下降趨勢(shì)，可能是晶D 型鹽酸小檗堿發(fā)生了一定程度的降解行為。綜合考慮4 種不同晶型自制片在3 種溶出介質(zhì)中的溶出行為，晶F 型自制片在所有介質(zhì)中都有較快的溶出行為，而晶C 型自制片都表現(xiàn)出較慢的溶出，晶B 型和晶D 型自制片在3 種溶出介質(zhì)中表現(xiàn)出不一致的溶出行為。

圖5 4 種晶型鹽酸小檗堿片在超純水（a）、醋酸鹽緩沖液（b）、磷酸鹽緩沖液（c）的溶出曲線Fig 5 Dissolution curve of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets in ultrapure water （a）， acetate buffer （b）and phosphate buffer （c）

3 討論

藥物多晶型現(xiàn)象對(duì)于藥物的研發(fā)具有極其重要的意義，約70%臨床使用的藥物為固體口服制劑，而且50%以上固體藥物存在多晶型現(xiàn)象。不同晶型藥物對(duì)藥物的吸濕性、穩(wěn)定性、生物利用度、藥效以及安全性等產(chǎn)生較大的影響[26]。由此固體藥物選擇一種合適的存在形式對(duì)于藥物應(yīng)用顯得尤為重要。鹽酸小檗堿在臨床上以鹽酸小檗堿片為主要用藥劑型，本研究中采用單一溶劑重結(jié)晶法制備了鹽酸小檗堿5 種晶型，從晶型微觀、紅外光譜、熱分析以及物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等多個(gè)方面對(duì)鹽酸小檗堿多晶型進(jìn)行表征，可以直觀且準(zhǔn)確地描繪出鹽酸小檗堿多晶型在各個(gè)方面的差異，為鹽酸小檗堿多晶型后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)參考。

本實(shí)驗(yàn)在前期優(yōu)化片劑制備工藝的基礎(chǔ)上，均采用最佳工藝條件進(jìn)行制片，設(shè)置原料藥晶型為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)單一變量，考察原料藥晶型因素對(duì)于片劑溶出度的影響。并依據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與指導(dǎo)原則》，根據(jù)藥物的理化性質(zhì)，充分考慮體內(nèi)環(huán)境因素的影響，應(yīng)選擇不同pH 的溶出介質(zhì)進(jìn)行溶出度的考察。實(shí)驗(yàn)中為模擬體內(nèi)胃腸道環(huán)境，純水、pH 1.2 的鹽酸溶液、pH 4.5 的醋酸鹽緩沖液和pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液被選擇為4 種不同pH 的溶出介質(zhì)。因在pH 1.2 的鹽酸溶液介質(zhì)中，鹽酸小檗堿的穩(wěn)定性不好，且在5～100 μg·mL－1線性關(guān)系不符合要求，故后續(xù)研究中剔除了pH 1.2的鹽酸溶液的溶出介質(zhì)?；诙嗑望}酸小檗堿的溶出行為結(jié)果，表明晶F 型自制片在所有介質(zhì)中都有較快的溶出行為，而比表面積較大的晶C 型自制片在各介質(zhì)中都表現(xiàn)出較慢的溶出。溶出速度從快到慢依次為針狀、片狀和柱狀，狹長針狀的溶出速度快于針狀。

綜上所述，本文從藥物晶型表征以及研究其對(duì)片劑溶出度的影響，發(fā)現(xiàn)晶型單晶比表面積對(duì)藥物溶出行為產(chǎn)生顯著的影響。后續(xù)研究可關(guān)注藥物晶型、粒徑、形貌等屬性對(duì)溶出行為的影響，以更加精準(zhǔn)地控制原料藥質(zhì)量，并根據(jù)臨床對(duì)藥物釋放速度的需求，選擇不同晶型的原料藥制備所需制劑。