徐 然，王馨悅，馮麟媛，韓安娜，王藝璇，楊萬山，劉 超

1.延邊大學腫瘤研究中心，吉林 延吉 133002；

2.民族地區(qū)高發(fā)腫瘤病理生物學國家民委重點實驗室（延邊大學），吉林 延吉 133002；

3.延邊大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 延吉 133002

神經(jīng)膠質(zhì)瘤也稱為膠質(zhì)細胞瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的60%，具有發(fā)病隱匿和惡性程度高等特點。由于其多呈彌漫侵襲性生長，手術(shù)切除效果差，且術(shù)后極易產(chǎn)生化療耐藥［1-3］。因此，探究新的生物標志物對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的早期診斷和治療具有重要意義。

凝縮蛋白復(fù)合物主要參與真核生物的有絲分裂和減數(shù)分裂中染色質(zhì)的凝縮過程，其在脊椎動物中可分為凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ和凝縮蛋白復(fù)合物Ⅱ。這兩種凝縮蛋白復(fù)合物均由SMC亞單位和非SMC亞單位構(gòu)成，其中NCAPG、NCAPH和NCAPD2三種亞基構(gòu)成了凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ的非SMC亞單位，而NCAPG2、NCAPH2和NCAPD3三種亞基構(gòu)成凝縮蛋白復(fù)合物Ⅱ的非SMC亞單位［4］。目前已有文獻報道了SMC2、SMC4、NCAPD3、NCAPG的功能紊亂會引起癌癥的發(fā)生、發(fā)展，例如，SMC2的異常表達與胰腺癌、胃癌及結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［5-6］，SMC4的過表達可以顯著提高膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力［7］，NCAPH表達上調(diào)時與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后明顯呈負相關(guān)［8］。雖已有研究［9］顯示，NCAPD2可作為肝癌和結(jié)直腸癌等的新型治療靶標，但目前關(guān)于NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達及其分子機制尚未見報道。因此，本文旨在探討NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達及生物學意義，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床診療提供可能的生物學指標。

1 材料和方法

1.1 病例選擇

腦膠質(zhì)瘤組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司，包括120例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織標本和3例正常腦組織標本。120例腫瘤患者中女性40例，男性80例；年齡＜50歲者79例，≥50歲者41例；浸潤周圍腦組織患者31例，無浸潤患者89例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期47例，Ⅲ+Ⅳ期73例。

1.2 細胞系

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系T98G、U87、SHG44、SHG66與神經(jīng)膠質(zhì)細胞系NHA均由延邊大學腫瘤研究中心提供。

1.3 主要試劑

NCAPD2抗體購自美國Abcam公司（貨號：ab34338），免疫組織化學試劑盒、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、檸檬酸緩沖液、蘇木精染劑和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和青霉素/鏈霉素均購自美國Gibco公司。

1.4 生物信息學分析

運用GEPIA數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancerpku.cn/）［10］分析NCAPD2 mRNA在腫瘤中的表達情況；運用Ualcan數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）［11］分析神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常組織中NCAPD2 mRNA的表達水平以及其與臨床病理學特征的關(guān)系；運用UCSC Xena數(shù)據(jù)庫（http://xena.ucsc.edu/）［12］以及單因素方差分析法分析NCAPD2 mRNA在原發(fā)與復(fù)發(fā)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達情況；運用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫（http://timer.cistrome.o r g/）［13］分析NCAPD2在異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤與甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（methylguanine methyltransferase，MGMT）突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達情況；運用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫（http://www.linkedomics.org/admin.php）［14］檢索神經(jīng)膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集，應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析與NCAPD2基因呈正負相關(guān)且P＜0.05的基因；采用Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）［15］和GOplot數(shù)據(jù)庫（http://wencke.github.io/）［16］對GO生物功能和Reactome基因集等進行富集分析。

1.5 免疫組織化學染色（S-P法）

將組織芯片從4 ℃冰箱中取出置于室溫下30 min 后于65 ℃烤箱烤片1 h，二甲苯、乙醇梯度脫蠟、水化，將組織芯片置于微波加熱的1%檸檬酸鹽緩沖液中水浴行抗原修復(fù)至室溫；PBS洗滌3 次，每次3 min；滴加H2O2溶液，室溫溫育20 min；P B S 洗滌組織芯片3 次，每次3 min；滴加一抗NCAPD2（稀釋濃度為1∶75），4 ℃冰箱溫育過夜；第2 天，取出組織芯片，室溫放置30 min，PBS洗滌組織芯片3次，每次3 min；滴加二抗試劑，室溫下溫育30 min；DAB顯色；蘇木精染劑復(fù)染，中性樹脂膠封片。PBS替代一抗作為陰性對照。

1.6 細胞培養(yǎng)

NHA、T98G、U87、SHG44、SHG66細胞于含有100 mL/L FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

使用RIPA裂解液裂解所收集細胞；提取細胞蛋白后采用BCA法檢測蛋白濃度；采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對蛋白進行電泳分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上；使用脫脂牛奶封閉2 h；于4 ℃冰箱溫育一抗過夜；采用洗膜緩沖液（tris buffered saline Tween，TBST）洗膜后溫育二抗2 h；使用電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）曝光液曝光。

1.8 結(jié)果判斷

NCAPD2以細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃棕色顆粒為組織化學染色陽性反應(yīng)。根據(jù)染色強度的評分標準：陰性無著色為0分，淺黃色為1分，黃棕色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細胞數(shù)所占比例的評分標準：0%～5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。將染色強度與陽性細胞數(shù)兩項評分相乘作為最終陽性等級：0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。其中（+）和（++）為低表達，（++）和（+++）為高表達。

1.9 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0軟件和GraphPad Prism7.0軟件進行分析。NCAPD2表達與臨床病理學特征的相關(guān)性分析采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗分析法。在UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用單因素方差分析NCAPD2基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達情況。在LinkedOmics數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析與NCAPD2基因呈正負相關(guān)且P＜0.05的基因。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達

應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，NCAPD2 mRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和直腸癌等多種惡性腫瘤組織中表達水平上調(diào)（P＜0.05，圖1）；Ualcan數(shù)據(jù)庫結(jié)果亦證實，NCAPD2 mRNA在156例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達水平顯著高于5例正常腦組織（P＜0.05，圖2A）；應(yīng)用UCSC Xena數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，631例樣本中NCAPD2基因在原發(fā)患者與復(fù)發(fā)患者中表達均顯著高于正常組織（P＜0.01，圖2B）。進一步通過Ualcan數(shù)據(jù)庫分析NCAPD2基因表達與神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床參數(shù)間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TP53基因突變能夠影響患者NCAPD2基因的表達水平（P＜0.05，圖3A）；同時在基于年齡和種族組的分析中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中NCAPD2基因的表達高于正常組織（P＜0.05，圖3B、3C），但其表達水平與患者性別無關(guān)（P＞0.05，圖3D）。應(yīng)用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫探究NCAPD2 mRNA表達水平與IDH突變型和MGMT突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)NCAPD2 mRNA僅在IDH1突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4），但在IDH2突變型和MGMT突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。上述結(jié)果提示NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達，且參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索NCAPD2 mRNA的表達Fig .1 Expression of NCAPD2 mRNA retrieved from GEPIA database

圖2 Ualcan數(shù)據(jù)庫與UCSC Xena數(shù)據(jù)庫中NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的表達Fig.2 Expression of NCAPD2 in glioma from Ualcan database and UCSC Xena database

圖3 Ualcan數(shù)據(jù)庫中基于TP53突變狀態(tài)、患者年齡、種族和性別的NCAPD2的差異表達Fig.3 Differential expression of NCAPD2 in patients with TP53 mutation status,age,ethnicity and gender in UALCAN database

圖4 數(shù)據(jù)庫中NCAPD2在IDH1/2突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤和MGMT突變型神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達水平Fig.4 The expression level of NCAPD2 in IDH1/2 mutated gliomas and MGMT mutated gliomas in the database

2.2 NCAPD2蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織與細胞中的表達

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中NCAPD2蛋白在細胞核與細胞質(zhì)中均有表達（圖5）。NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的陽性率為91.7%（110/120），強陽性率為75.8%（91/120）。在正常腦組織中，NCAPD2蛋白的陽性率和強陽性率均為0.0%。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中NCAPD2蛋白的陽性表達率顯著高于正常腦組織（P＜0.01，表1）。進一步通過Western blot實驗分析NCAPD2蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的表達情況，結(jié)果顯示，NCAPD2蛋白在T98G、U87、SHG44、SHG66神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中均表達上調(diào)，且顯著高于NHA神經(jīng)膠質(zhì)細胞（P＜0.05，圖6）。

圖5 采用免疫組織化學S-P染色法檢測NCAPD2在腫瘤組織中的表達Fig.5 Expression of NCAPD2 in tumor tissues detected by immunohistochemical S-P staining

圖6 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中NCAPD2的表達高于正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞Fig 6 The expression of NCAPD2 was higher in glioma cells than in normal glial cells

表1 正常組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的NCAPD2蛋白的表達Tab.1 Expression of NCAPD2 protein in normal tissue and glioma tissue

2.3 NCAPD2蛋白的表達水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床病理學特征的關(guān)系

進一步分析NCAPD2蛋白表達水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床病理學特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，NCAPD2蛋白高表達與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床分期呈正相關(guān)（P＜0.05），但與患者的年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小及腫瘤是否浸潤組織等情況均無關(guān)（P＞0.05）。其中，NCAPD2蛋白在Ⅰ+Ⅱ期神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的強陽性表達率（39/47，83.0%）顯著高于Ⅲ+Ⅳ期神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織（48/73，65.8%）（P＜0.05），提示NAPD2蛋白可能參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的過程（表2）。

表2 NCAPD2表達與神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理學特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression of NCAPD2 and clinicopathology characteristics of glioma

2.4 NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的共表達基因以及參與的生物學進程

應(yīng)用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NCAPD2的相關(guān)基因進行分析，結(jié)果顯示，共有5911個與NCAPD2相關(guān)的基因；進一步通過熱圖顯示，NCAPD2與CCNF、FOXM1等1772個基因與呈正相關(guān)（P＜0.05，圖7A），而與SERPINB6、IDH3A等4139個基因則呈負相關(guān)（P＜0.05，圖7B）。接下來選取與NCAPD2呈正負相關(guān)的各前50個基因運用Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析（圖8A、8B），結(jié)果顯示，與NCAPD2呈正相關(guān)的共表達基因均參與促進細胞周期、DNA修復(fù)、染色體分離和DNA構(gòu)象變化等生物功能（P＜0.01），與NCAPD2呈負相關(guān)的共表達基因則與細胞氧化解毒、白細胞脫顆粒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工等生物學功能相關(guān)（P＜0.05）。進一步在Metascape數(shù)據(jù)庫分析的基礎(chǔ)上各篩選了與NCAPD2呈正負相關(guān)的前15個基因并且采用GOplot數(shù)據(jù)庫分析，弦圖進一步說明，NCAPD2與其共表達基因主要參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞周期、DNA修復(fù)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工等生物學功能及相關(guān)進程（圖8C）。

圖7 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫對神經(jīng)膠質(zhì)瘤與NCAPD2相關(guān)基因的分析Fig.7 LinkedOmics database and the analysis of gene related to NCAPD2 in glioma

圖8 Metascape數(shù)據(jù)庫和GOplot數(shù)據(jù)庫分析與NCAPD2共表達基因的生物學功能Fig.8 Biological functions of genes co-expressed with NCAPD2 were analyzed by Metascape and GoPlot databases

3 討 論

凝縮蛋白是一種通過轉(zhuǎn)導分子內(nèi)部交聯(lián)從而促使DNA形成卷曲的螺旋，在染色體凝集過程中發(fā)揮其功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于細胞的有絲分裂可以維持個體的生長和發(fā)育，且染色質(zhì)凝縮關(guān)系著細胞有絲分裂時基因組之間是否可以進行準確地分離，所以凝縮蛋白復(fù)合物在有絲分裂等細胞增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NCAPD2作為非SMC凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ的亞基在細胞的有絲分裂和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮關(guān)鍵的染色體組裝和分離作用［17］。據(jù)相關(guān)報道［9］，干預(yù)NCAPD2可以影響細胞正常的有絲分裂進程。SMC2和MYCN基因可以通過相互作用調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)［18］。此外，NCAPD2基因與帕金森病的發(fā)病有關(guān)［19］。有報道預(yù)測，NCAPD2可以作為卵巢癌的治療靶標［20］，并可作為肝癌和結(jié)直腸癌等的生物標志物［21］，但神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NCAPD2的表達水平及臨床意義尚未見報道。

本研究運用GEPIA、Uaclan和UCSC Xena數(shù)據(jù)庫分析了NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達情況，發(fā)現(xiàn)NCAPD2不僅在多種惡性腫瘤中呈高表達，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達也高于正常腦組織（P＜0.05）。其中NCAPD2 mRNA的表達是基于TP53突變表達基礎(chǔ)上，其與年齡、種族有關(guān)（P＜0.05），而與性別無關(guān)，并且NCAPD2基因在原發(fā)與復(fù)發(fā)組織中的表達顯著高于正常組織（P＜0.01）。通過免疫組織化學S-P法對膠質(zhì)瘤芯片進行染色，進一步深入分析發(fā)現(xiàn)，NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達顯著高于正常腦組織（P＜0.05），這一結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果相同，且病理學參數(shù)分析結(jié)果顯示，NCAPD2的高表達與臨床分期呈正相關(guān)（P＜0.05）。進一步的Western blot實驗結(jié)果顯示，NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的表達顯著高于神經(jīng)膠質(zhì)細胞（P＜0.05）。這與Emmanuel等［20］在卵巢癌中的研究思路相吻合，其結(jié)果顯示，NCAPD2在卵巢癌中高表達并且可能是卵巢癌的候選預(yù)測基因。與撒云俐［21］在結(jié)直腸癌中NCAPD2高表達促進癌癥進程的研究結(jié)果類似，提示NCAPD2高表達參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)展。

接下來Murakami-Tonami等［18］研究表明，凝縮蛋白復(fù)合物基因可以通過合作來轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)。Yin等［8］研究發(fā)現(xiàn)，NCAPH高表達可促進結(jié)腸癌細胞凋亡。Zhang等［22］研究發(fā)現(xiàn)，NCAPG是肝癌細胞增殖和遷移所需基因，并且NCAPG的高表達與肝癌患者的復(fù)發(fā)緊密相關(guān)。為此，本研究通過生物信息學分析探究了NCAPD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中是否也參與相關(guān)的生物學功能和相關(guān)進程，運用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫、Metascape數(shù)據(jù)庫和GOplot數(shù)據(jù)庫繼續(xù)挖掘NCAPD2基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫篩選并選取與NCAPD2呈正負相關(guān)且P＜0.05的基因進行分析，同時應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫與GOplot數(shù)據(jù)庫提取與NCAPD2正負相關(guān)的基因進一步進行分析。結(jié)果表明，NCAPD2與其共表達基因（如CCNF、LMNB1和FOXM1等）主要參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的細胞周期、DNA修復(fù)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白加工等生物學功能和相關(guān)進程。這與Je等［5］和Shiheido等［23］的研究相一致，同為凝縮蛋白復(fù)合物亞基的SMC2、NCAPG能夠以高表達的狀態(tài)促進細胞周期進程，加快腫瘤細胞生長與增殖速度，提示NCAPD2可能同樣通過調(diào)控細胞周期進而促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的生長與增殖，但其分子機制有待進一步探究。

綜上所述，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NCAPD2呈高表達，與臨床分期呈正相關(guān)，并參與細胞周期及DNA修復(fù)等過程，有望成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤診療的新分子靶標。