陸 立，盧仁泉，孫佳俊，陸 凝，郭 林

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

原發(fā)性肺癌是中國(guó)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位居各類癌癥首位，其發(fā)病隱匿，約50%的患者確診時(shí)為晚期［1-2］。骨骼是肺癌主要的轉(zhuǎn)移部位之一，首診肺癌晚期患者中骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率為30%～40%，其中80%以上位于軀干骨中，包括脊柱、肋骨和骨盆［3-5］。骨轉(zhuǎn)移往往預(yù)示著患者的生存期縮短，其引起的嚴(yán)重骨痛、病理性骨折、脊髓壓迫綜合征等骨相關(guān)事件（skeletal-related events，SRE）及相關(guān)治療帶來(lái)的痛苦，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［6］。臨床數(shù)據(jù)表明，肺癌合并骨轉(zhuǎn)移患者在發(fā)生首次SRE后，中位生存時(shí)間僅為4.1個(gè)月［7］。因此，如何早期診斷骨轉(zhuǎn)移，進(jìn)行療效的監(jiān)測(cè)評(píng)估，對(duì)延長(zhǎng)肺癌患者的生存期及改善預(yù)后意義重大。目前，骨轉(zhuǎn)移的診斷主要依賴影像學(xué)檢查，如發(fā)射型計(jì)算機(jī)體層成像（emission computed tomography，ECT）和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)體層顯像（positron emission tomography and computed tomography，PET/CT）檢查等。這些檢查部分存在特異度較低、易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果、價(jià)格相對(duì)昂貴、難以反復(fù)檢查等缺點(diǎn)［8-9］。而臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）、細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）等，主要用于肺癌患者的鑒別診斷。有研究［10-11］表明，上述腫瘤標(biāo)志物也可應(yīng)用于腫瘤分期、療效判斷和預(yù)后評(píng)估，但并未證實(shí)其與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。

肺癌骨轉(zhuǎn)移的病理學(xué)基礎(chǔ)主要是腫瘤細(xì)胞與破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞間的相互作用，腫瘤細(xì)胞釋放的可溶性介質(zhì)能夠激活破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，而破骨細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子又能進(jìn)一步促進(jìn)前者釋放介質(zhì)，從而形成惡性循環(huán)，破壞正常骨組織中骨吸收與骨形成的動(dòng)態(tài)平衡［12-13］。骨代謝紊亂使得骨代謝指標(biāo)發(fā)生變化。已有相關(guān)研究［14-16］表明，檢測(cè)血清中骨代謝指標(biāo)的表達(dá)水平對(duì)肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷和監(jiān)測(cè)具有潛在價(jià)值。本研究對(duì)231例原發(fā)性肺癌患者及69名健康體檢者的N端中分子片段（N-terminal mid-frament，N-MID）表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，探索其在臨床應(yīng)用中的價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017年3月—2018年2月復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的原發(fā)性肺癌患者231例，中位年齡61歲（21～82歲），其中97例為肺癌合并骨轉(zhuǎn)移的患者，134例為未骨轉(zhuǎn)移的肺癌患者。肺癌的確診以活檢或組織細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為準(zhǔn)，骨轉(zhuǎn)移的確診以ECT或PET/CT檢查結(jié)果為準(zhǔn)［17-19］。選取69名同期健康體檢者作為健康對(duì)照組，中位年齡60歲（22～87歲），所有健康體檢者均無(wú)影響骨代謝的相關(guān)疾病。3組人群的基本資料見表1，各組的性別、年齡間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，所有患者均由本人或家屬簽署知情同意書。

表1 研究人群一般資料比較Tab.1 General information of study population(n)

1.2 入組與排除標(biāo)準(zhǔn)

入組標(biāo)準(zhǔn)：所有肺癌患者均為未經(jīng)治療的初發(fā)患者；Karnofsky評(píng)分（Karnofsky performance score，KPS）≥70分［18］。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有骨代謝性疾??；有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎病史；患有骨質(zhì)疏松、甲狀腺功能亢進(jìn)，或由甲狀旁腺功能亢進(jìn)和皮質(zhì)醇增多癥等引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松；合并嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病。

1.3 標(biāo)本采集與檢測(cè)方法

采集患者及健康體檢者靜脈血3～4 mL，以4000 r/min的速度離心10 min，取上層血清，立即檢測(cè)或置于-80 ℃冰箱內(nèi)凍存，1周內(nèi)檢測(cè)。血清N-MID水平測(cè)定采用嘉興行健生物科技有限公司的N-MID測(cè)定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）。將校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測(cè)樣品加入鏈霉親和素包被的微孔板中，隨后加入生物素標(biāo)記的N-MID抗體和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的N-MID抗體混合物，進(jìn)行溫育形成“雙抗體夾心”結(jié)構(gòu)。洗滌后加入HRP基質(zhì)溶液，再次溫育。微孔板內(nèi)壁的免疫復(fù)合體的酶活性與血清N-MID的濃度成正比。加入終止液后，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度（D）值。血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平測(cè)定采用瑞士Roche公司的cobas8000-e801自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、血清鈣（calcium，Ca）水平測(cè)定采用瑞士Roche公司的cobas8000-c702全自動(dòng)生化分析儀。

1.4 隨訪

研究截止時(shí)間為2021年1月，隨訪終點(diǎn)為研究截止時(shí)間、患者骨轉(zhuǎn)移病灶發(fā)生進(jìn)展或患者死亡，所有患者均采用含鉑雙藥聯(lián)合化療，同時(shí)聯(lián)合唑來(lái)膦酸治療。記錄患者的無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）［19］。另檢測(cè)50例肺癌合并骨轉(zhuǎn)移患者治療3、6個(gè)月后的血清N-MID水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析進(jìn)行3組間差異比較，方差分析有意義則采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法進(jìn)行各組間率的比較。采用logistic回歸模型分析肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估N-MID對(duì)肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較采用log-rank檢驗(yàn)。采用重復(fù)資料方差分析比較肺癌合并骨轉(zhuǎn)移患者治療期間血清N-MID水平的變化差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究人群治療前血清N-MID表達(dá)水平比較

治療前骨轉(zhuǎn)移組的肺癌患者血清N-MID水平明顯高于無(wú)骨轉(zhuǎn)移組和健康對(duì)照組（P均＜0.001）。而無(wú)骨轉(zhuǎn)移組與健康對(duì)照組間N-MID水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 3組研究人群治療前血清N-MID表達(dá)水平比較Fig.1 Serum N-MID levels of three groups before treatment

2.2 肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析

采用logistic回歸模型進(jìn)行分析。首先分別對(duì)患者的性別、年齡、Ca、CEA、NSE、CYFRA21-1、ALP和N-MID進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，CEA（OR=2.448）、NSE（OR=3.308）、CYFRA21-1（OR=2.125）、ALP（OR=4.247）、N-MID（OR=10.027）是肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。綜合上述單因素分析中有意義的因素進(jìn)行多因素聯(lián)合分析，結(jié)果顯示，血清N-MID（OR=9.265）和NSE水平（OR=2.688）是肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素（表2）。

表2 肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析Tab.2 The risk factors of bone metastasis in patients with lung cancer

2.3 血清N-MID表達(dá)水平對(duì)肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值

依據(jù)治療前3組研究人群的血清N-MID檢測(cè)結(jié)果繪制ROC曲線，曲線下面積（area under curve，AUC）為0.849（圖2）。選擇約登指數(shù)最大的切點(diǎn)為臨界點(diǎn)，確定N-MID的最佳臨界值為14.96 ng/mL，此時(shí)血清N-MID對(duì)肺癌患者骨轉(zhuǎn)移診斷的靈敏度為77.32%，特異度為78.33%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為63.0%，陰性預(yù)測(cè)值為87.8%。

圖2 血清N-MID診斷肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的ROC曲線Fig.2 ROC curve of serum N-MID for the diagnosis of bone metastasis in patients with lung cancer

2.4 肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的PFS分析

依據(jù)最佳臨界值，將肺癌患者分為N-MID＞14.96 ng/mL組和N-MID≤14.96 ng/mL組，繪制生存曲線，結(jié)果顯示，N-MID＞14.96 ng/mL組患者的PFS明顯低于N-MID≤14.96 ng/mL組患者（HR=2.040，P=0.021，圖3）。

圖3 不同N-MID水平患者的PFSFig.3 PFS of patients with different N-MID levels

2.5 血清N-MID表達(dá)水平對(duì)肺癌合并骨轉(zhuǎn)移患者的療效監(jiān)測(cè)

對(duì)50例肺癌合并骨轉(zhuǎn)移患者治療3、6個(gè)月后的血清N-MID水平進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)患者是否發(fā)生SRE、疼痛緩解情況及活動(dòng)受限改善情況分為疾病緩解組和疾病未見緩解或加重組，其中疾病緩解組有33例患者，疾病未見緩解或加重組有17例。治療后疾病緩解患者在治療3、6個(gè)月后的血清N-MID水平較治療前明顯下降，且治療6個(gè)月后的N-MID水平較治療3個(gè)月后也明顯下降（P均＜0.001）。治療后疾病未見緩解或加重組患者的血清N-MID水平較治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 治療后不同療效患者的N-MID表達(dá)水平變化Fig.4 Changes of N-MID levels in patients with different therapeutic effects after treatment

3 討 論

以ECT和PET/CT為主的影像學(xué)檢查目前仍是肺癌患者骨轉(zhuǎn)移主要的診斷方法［20］。影像學(xué)檢查能夠?qū)寝D(zhuǎn)移病灶的部位、數(shù)量和大小進(jìn)行分辨和顯示，但存在費(fèi)用昂貴、檢測(cè)條件苛刻和特異性不高等問(wèn)題，難以應(yīng)用于人群篩查、短期多次復(fù)查及長(zhǎng)期疾病監(jiān)測(cè)［21-22］。因此，臨床上仍需探究更高效便捷的骨轉(zhuǎn)移評(píng)估方法。

骨鈣素（osteocalcin，OC）是主要由非增殖期成骨細(xì)胞合成并特異性分泌的一種小分子球狀蛋白質(zhì)［23］。OC的羧化谷氨酸在鈣離子存在的條件下能夠促進(jìn)其與羥磷灰石結(jié)合并沉積于細(xì)胞外骨基質(zhì)，從而促進(jìn)骨骼發(fā)育，有研究［24-25］表明，OC具有趨化和激活破骨細(xì)胞的能力，其羧化末端對(duì)破骨細(xì)胞的前體有化學(xué)誘導(dǎo)作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨吸收。部分OC會(huì)釋放入血，完整的OC在外周血中不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)蛋白酶水解后，血清中約1/3為完整OC，1/3為氨基酸短肽，1/3為裂解后的N-MID［26］。N-MID在血清中具有良好的穩(wěn)定性，能夠反映骨中的OC水平，繼而反映成骨細(xì)胞的活性以及骨形成和骨吸收的情況，是一項(xiàng)靈敏度和特異度均較高的骨代謝指標(biāo)。多項(xiàng)研究［27-29］表明，血清N-MID水平可作為診斷乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的敏感指標(biāo)，在骨轉(zhuǎn)移患者中其水平顯著升高。本研究結(jié)果顯示，治療前骨轉(zhuǎn)移組的肺癌患者血清N-MID水平明顯高于無(wú)骨轉(zhuǎn)移組和健康對(duì)照組，而無(wú)骨轉(zhuǎn)移組與健康對(duì)照組間的N-MID水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明肺癌患者N-MID水平升高與發(fā)生骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，N-MID（OR=9.265）和NSE（OR=2.688）是肺癌患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。NSE作為肺癌診斷和監(jiān)測(cè)的敏感指標(biāo)，可提示肺癌患者的臨床分期和疾病進(jìn)展，在患者發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后易產(chǎn)生波動(dòng)，而N-MID與骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)程度最高。ROC曲線顯示，血清N-MID診斷肺癌患者骨轉(zhuǎn)移的AUC為0.849，具有較高的診斷價(jià)值。以上結(jié)果表明，血清N-MID可作為肺癌患者骨轉(zhuǎn)移輔助診斷的有效指標(biāo)，這與相關(guān)研究［30-32］的結(jié)果一致。

在肺癌合并骨轉(zhuǎn)移患者的治療過(guò)程中，對(duì)疾病進(jìn)展和療效的監(jiān)測(cè)，以及對(duì)預(yù)后的評(píng)估，是指導(dǎo)臨床選擇合理治療方案，提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵，也是臨床醫(yī)師關(guān)注的重點(diǎn)［33-35］。肺癌骨轉(zhuǎn)移的臨床治療主要采用含鉑雙藥聯(lián)合化療，同時(shí)聯(lián)合雙磷酸鹽治療，必要時(shí)應(yīng)用鎮(zhèn)痛類藥物或放療，唑來(lái)膦酸是目前使用最廣泛的雙磷酸鹽類藥物［36-37］。唑來(lái)膦酸能夠抑制破骨細(xì)胞的成熟和聚集，也可以抑制成熟破骨細(xì)胞的活性和功能，從而減少骨吸收，使得因骨轉(zhuǎn)移而紊亂的骨代謝水平趨于穩(wěn)定［38-39］。因此，通過(guò)比較N-MID等骨代謝標(biāo)志物的濃度變化，可以觀察肺癌患者的療效和預(yù)后。本研究通過(guò)對(duì)療效和預(yù)后進(jìn)行隨訪評(píng)估，依據(jù)最佳臨界值對(duì)患者進(jìn)行分類，記錄不同血清N-MID水平下患者的PFS，發(fā)現(xiàn)N-MID＞14.96 ng/mL組患者的PFS明顯低于N-MID≤14.96 ng/mL組患者（HR=2.040），說(shuō)明N-MID水平越高，患者疾病進(jìn)展越快，預(yù)后越差。本研究發(fā)現(xiàn)治療后疾病緩解患者的N-MID水平降低，而疾病未見緩解或加重患者的N-MID水平無(wú)明顯變化。由此可見，血清N-MID水平在肺癌合并骨轉(zhuǎn)移患者的療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估中有指導(dǎo)作用。

本研究的局限性在于病例數(shù)有限，尤其是肺癌合并骨轉(zhuǎn)移患者的隨訪例數(shù)少，隨訪時(shí)間較短，仍有待大樣本前瞻性研究進(jìn)一步分析血清N-MID水平在患者隨訪中的應(yīng)用，證實(shí)N-MID在肺癌患者骨轉(zhuǎn)移輔助診斷和療效監(jiān)測(cè)方面的作用。