張一帆，馮世坤

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

Mstn，即肌肉生長抑制素（myostain），又稱生長分化因子-8（growth and differentiationfactor 8，gdf8），是TGF-β超家族的成員，對(duì)骨骼肌生長發(fā)育有著負(fù)向調(diào)節(jié)作用[1]。同時(shí)具有調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝的功能，參與胚胎發(fā)育的調(diào)控和動(dòng)物體內(nèi)各組織平衡[2]。有研究表明，mstn可在哺乳動(dòng)物，如人，小鼠，牛等的卵巢中表達(dá)。Cheewasopit[3]等發(fā)現(xiàn)牛卵巢中的mstn可促進(jìn)顆粒細(xì)胞Cyp19a1的表達(dá)和雌二醇的產(chǎn)生。雌激素具有加速卵巢生長的作用，因而mstn可能對(duì)性腺分化發(fā)育有影響。然而在硬骨魚類中尚未見mstn對(duì)卵巢分化發(fā)育作用相關(guān)的報(bào)道。

由于魚類相對(duì)特殊的基因復(fù)制，很多硬骨魚類的mstn基因包含兩個(gè)亞型，即mstn1和mstn2。有研究表明淇河鯽兩種mstn基因在許多組織中均有表達(dá)[4]。其中mstn1主要在肌肉和大腦中表達(dá)，而mstn2主要在大腦中表達(dá)。但Mstn蛋白在組織細(xì)胞中定位的研究較為匱乏。為了明確淇河鯽Mstn蛋白在組織中的細(xì)胞定位，特別是不同時(shí)期卵巢組織中的表達(dá)情況。本研究采集淇河鯽的腦、鰓、脾、肝、腸、腎、頭腎，紅肌和白肌，通過半定量PCR檢測(cè)mstn基因的mRNA在淇河鯽各組織表達(dá)水平；采用免疫組化的方式進(jìn)行Mstn基因的細(xì)胞定位。從而對(duì)mstn在組織中的表達(dá)情況進(jìn)行闡述，進(jìn)而探究mstn是否具有除刺激肌肉發(fā)育以外的作用。

淇河鯽（Carassius auratus in Qihe river) 屬鯉形目（Cypriniformes) 鯉科（Cyprinidae) 鯉亞科（Cyprinidae)，原產(chǎn)于河南省北部的淇河，因而稱之為淇河鯽，是河南省農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志。淇河鯽是天然的三倍體魚類，具有兩性生殖和雌核發(fā)育兩種繁殖方式。通過異源精子刺激，進(jìn)行雌核發(fā)育，可產(chǎn)生全雌性個(gè)體[5]。這為我們進(jìn)行卵巢各時(shí)期mstn鑒定奠定基礎(chǔ)。在自然界中淇河鯽的生長速度快，其背脊厚度是普通鯽魚的2倍，出肉率也高于普通鯽魚、日本白鯽和方正鯽，其肌肉中蛋白質(zhì)含量為18.43%～19.51%，高于黃河鯉（18.19%～18.45%）。同時(shí)含有較高谷氨酸，因而味道鮮美，具有極大的發(fā)展前景。迄今為止，mstn在硬骨魚類卵巢分化發(fā)育的方面的研究較少。本研究以淇河鯽為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過檢測(cè)Mstn在淇河鯽卵巢各時(shí)期的表達(dá)情況及其細(xì)胞定位，探究Mstn對(duì)淇河鯽卵巢分化發(fā)育的影響，以此來為之后魚類該基因的功能研究提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地的淇河鯽作為實(shí)驗(yàn)材料。養(yǎng)殖采用帶有循環(huán)曝氣淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)的大型養(yǎng)殖池。環(huán)境溫度保持在24℃左右，光照周期為14 h光照、10 h黑暗。在繁殖季節(jié)將雌性淇河鯽與雄性鯉魚按8：1的比例放入親魚池，人工誘導(dǎo)產(chǎn)卵。受精卵在23℃的環(huán)境下孵育，直至發(fā)育成幼魚。孵化期間定期觀察胚胎發(fā)育情況。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。通過MS-222溶液浸泡對(duì)魚進(jìn)行麻醉，盡量降低實(shí)驗(yàn)過程魚中受到的痛苦。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

用MS-222試劑麻醉淇河鯽，剖取腦、鰓、心臟、頭腎、脾、肝、腸、腎、紅肌、白肌，每個(gè)組織各取三個(gè)獨(dú)立樣本，迅速放入液氮中冷凍，后在-80℃中保存。同樣方法取不同發(fā)育時(shí)期的卵巢組織。用TaKaRa RNAiso Plus（TaKaRa，大連）試劑盒提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA是否被污染，條帶是否完整。分光光度計(jì)檢測(cè)RNA OD值及RNA濃度。選取A260/A280為1.8～2.0的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（含gDNA Eraser）（TaKaRa，大連）合成cDNA第一鏈。

1.3 半定量PCR、實(shí)時(shí)定量PCR和統(tǒng)計(jì)分析

采用半定量PCR的方法測(cè)定mstn基因在淇河鯽各組織中的表達(dá)情況。以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行半定量PCR。采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)mstn基因在淇河鯽卵巢的表達(dá)情況，計(jì)算不同組織相對(duì)表達(dá)量，用SPSS軟件分析差異的顯著性，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）的方式進(jìn)行表示，顯著水平為P<0.05。

1.4 Mstn蛋白的組織分布

為了進(jìn)行組織分布分析，取健康淇河鯽成魚組織，如腦、鰓、脾、肝、腸、腎等。并采集30、40、60 dah等不同發(fā)育時(shí)期的卵巢組織。室溫環(huán)境下，在超凈臺(tái)內(nèi)解剖，波恩氏液固定過夜。脫水透明后，石蠟包埋切片，片厚5 μm。石蠟切片脫蠟，復(fù)水處理后，用一級(jí)抗體和二級(jí)抗體孵育，蘇木精染色，梯度酒精脫水后，中性樹膠封片。顯微鏡觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)是否完整，是否具有陽性信號(hào)，并用顯微鏡采集分析系統(tǒng)鏡鑒，拍照保存以待分析。卵巢中淇河鯽Mstn的免疫定位用作陽性對(duì)照，而正常兔血清用作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 Mstn基因在淇河鯽各組織中的表達(dá)特征

以β-actin作為內(nèi)參基因，通過半定量PCR測(cè)定淇河鯽各組織中mstn基因表達(dá)量。結(jié)果表明（圖1），mstn1在腦，紅肌和白肌中表達(dá)量高，而mstn2則在腦，肝和紅肌中表達(dá)量高。兩種mstn在腎和頭腎中表達(dá)較低，在其他組織中幾乎檢測(cè)不到。

圖1 淇河鯽不同組織中mstn1和mstn 2 mRNA的表達(dá)情況

2.2 Mstn蛋白在淇河鯽不同組織中的細(xì)胞定位

為確定Mstn蛋白在淇河鯽不同組織表達(dá)的細(xì)胞類型，我們進(jìn)行了免疫組化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，Mstn蛋白陽性信號(hào)在各組織中普遍表達(dá)（圖2）。其中，Mstn在腦中主要表達(dá)在放射性膠質(zhì)細(xì)胞，在腸中為腸絨毛上皮細(xì)胞，在腎中為腎小管上皮細(xì)胞，在頭腎中為腎間細(xì)胞，在紅肌和白肌中均為肌細(xì)胞，在肝中為中央靜脈與門管區(qū)，在脾中為紅髓，在卵巢中為間質(zhì)細(xì)胞，在鰓中為支柱細(xì)胞。

圖2 Mstn在組織中表達(dá)情況

2.3 Mstn1和Mstn2在淇河鯽卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜

通過實(shí)時(shí)定量PCR 的方法檢測(cè)mstn在淇河鯽卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜。結(jié)果表明（圖3），在卵巢發(fā)育早期mstn基因就已開始表達(dá)。其中mstn1在淇河鯽卵巢分化的關(guān)鍵時(shí)期（40 dah)急劇上調(diào)，隨后下調(diào)；在卵巢發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期（150 dah)時(shí)顯著升高（P<0.05)。而mstn2在5到90 dah時(shí)呈顯著下降趨勢(shì)，在120，150 dah時(shí)逐漸升高，在210，720 dah時(shí)減少并保持穩(wěn)定。

圖3 mstn1和mstn2在淇河鯽卵巢不同時(shí)期表達(dá)量

2.4 Mstn蛋白在淇河鯽不同時(shí)期卵巢中的細(xì)胞定位

通過免疫組化檢測(cè)Mstn在淇河鯽在不同時(shí)期的卵巢中的表達(dá)，結(jié)果顯示Mstn從30 dah開始在卵巢間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)（圖4）。

圖4 Mstn在卵巢不同時(shí)期表達(dá)情況

3 討論

Mstn基因在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)特異性強(qiáng)，一般只在骨骼肌中表達(dá)。但是魚類作為低等脊椎動(dòng)物，mstn基因的表達(dá)出現(xiàn)了多樣性。由于魚類相對(duì)特殊的基因復(fù)制，很多硬骨魚類的mstn基因包含兩個(gè)亞型，即mstn1和mstn2。本研究以淇河鯽為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，檢測(cè)mstn在其組織分布情況及卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜，同時(shí)采用免疫組化的方法進(jìn)行細(xì)胞定位。半定量PCR結(jié)果顯示mstn1在淇河鯽腦，紅肌和白肌中表達(dá)量高，而mstn2則在腦，肝和紅肌中表達(dá)量高，這與我們前期定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致[4]。兩種mstn在腎和頭腎中表達(dá)較低，在其他組織中幾乎檢測(cè)不到。有研究表明在其他魚類，如虹鱒[6]、大馬哈魚[7]等，兩種亞型的mstn基因的組織表達(dá)分布也不相同。虹鱒[6]的mstn1在肌肉、腦、心臟、腎、肝、腸、鰓及性腺中均有表達(dá)，mstn2只在腦和肌肉中表達(dá)。大馬哈魚[6]的mstn1在肌肉、腦、腸、鰓、舌、眼、脾和卵巢中表達(dá)，mstn2在肌肉、腦、舌、眼鰓中表達(dá)。這與我們的研究結(jié)果類似。

免疫組化結(jié)果顯示Mstn蛋白陽性信號(hào)在腦部的放射性膠質(zhì)細(xì)胞，腸道的腸絨毛上皮細(xì)胞，腎臟的腎小管上皮細(xì)胞，頭腎的腎間細(xì)胞，紅肌和白肌的肌細(xì)胞，肝臟的中央靜脈與門管區(qū)，脾臟的紅髓，卵巢的間質(zhì)細(xì)胞，鰓的支柱細(xì)胞中表達(dá)。這兩種Mstn蛋白在肌肉中的高表達(dá)意味著它在淇河鯽生長方面的關(guān)鍵作用。Mstn2在腦中的顯著表達(dá)表明其可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育方面有影響。Mstn基因在魚類體內(nèi)的廣泛分布及不同亞型的不同組織表達(dá)結(jié)果，意味著它們?cè)阡亢遇a生長發(fā)育的過程中可能發(fā)揮著不同的作用，不僅限于調(diào)控肌肉生長。

此外，實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)淇河鯽卵巢發(fā)育不同時(shí)期中mstn基因表達(dá)的鑒定表明在卵巢發(fā)育早期mstn基因就已經(jīng)開始表達(dá)。Amali[8]等在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)mstn的表達(dá)是母源性的，其在I細(xì)胞中就開始表達(dá)。本研究的結(jié)果表明，在卵巢不同發(fā)育時(shí)期，兩個(gè)mstn基因的表達(dá)水平也有所不同。在40 dah時(shí)期以及發(fā)育中后期時(shí)，mstn1的表達(dá)量較高。而mstn2的表達(dá)量則在發(fā)育早期較高，即除40 dah的5～60 dah的時(shí)期，其余水平均低于mstn1，且在發(fā)育后期210、720 dah時(shí)顯著下降。研究表明，在40 dah時(shí)，淇河鯽正處于卵巢分化的關(guān)鍵時(shí)期，150到210 dah是淇河鯽卵巢發(fā)育的時(shí)期，在此期間，mstn1的高表達(dá)預(yù)示著mstn基因參與淇河鯽卵巢分化及后續(xù)的卵巢發(fā)育。而mstn2在卵巢早期的高表達(dá)可能預(yù)示著其對(duì)卵巢發(fā)育早期具有促進(jìn)作用。

免疫組化結(jié)果顯示，在淇河鯽不同發(fā)育時(shí)期卵巢中Mstn在間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。卵巢間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成卵巢間質(zhì)區(qū)，卵巢間質(zhì)區(qū)為卵泡提供生長和發(fā)育的環(huán)境。Mstn蛋白在卵巢間質(zhì)細(xì)胞中的高表達(dá)可能意味著該基因有維持卵巢環(huán)境穩(wěn)定和刺激卵泡發(fā)育的作用。有研究表明，在哺乳動(dòng)物中Mstn在顆粒細(xì)胞中表達(dá)，具有促進(jìn)Cyp19a1表達(dá)，雌激素產(chǎn)生的作用[3]。Mstn蛋白也在淇河鯽體細(xì)胞及成魚顆粒細(xì)胞中表達(dá)，這意味著它可能也會(huì)促進(jìn)cyp19a1合成，進(jìn)而影響卵巢分化發(fā)育。

綜上所述，Mstn基因在淇河鯽各組織中普遍表達(dá)，這說明其可能參與淇河鯽生長發(fā)育各個(gè)階段，不僅僅局限于肌肉生長。且它在卵巢各時(shí)期的表達(dá)研究也表明該基因具有影響卵巢分化發(fā)育的作用。這為探究mstn基因在卵巢發(fā)育過程中的調(diào)控提供了一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但其在卵巢中的具體作用還需進(jìn)一步研究。