陽(yáng) 霞，韋露萍，陳子豪，陳婉婷，趙永清，2

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124）

冬凌草（Rabdosia rubescens）又名冰凌草、延命草、彩花草等，唇形科香茶菜屬植物，陽(yáng)性耐陰植物，略喜陰，抗寒性強(qiáng)，能耐-20 ℃低溫，10～40 ℃適宜生長(zhǎng)，溫度低于5 ℃基本停止生長(zhǎng)。萌蘗力強(qiáng)，耐干旱、瘠薄，即使夏季土壤含水量低于4%，冬凌草仍能夠生長(zhǎng)。適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)土壤要求不高，土層深厚、土壤肥沃、砂質(zhì)壤土[1-2]、pH值 6.5～8.0，冬凌草生長(zhǎng)最佳?；ㄆ?—10月，盛花期9月。在我國(guó)河南、山西、河北、湖南、湖北、四川、貴州、廣西、云南、陜西等地均有分布，主產(chǎn)地在河南濟(jì)源太行山一帶，最早收載于《救荒本草》[3-4]。冬凌草味甘苦、性微寒，具有清熱解毒、消炎止痛及抗腫瘤等作用[4-9]。冬凌草中含有二萜類、三萜類、多糖、生物堿類、黃酮、揮發(fā)油、內(nèi)酯、有機(jī)酸等化學(xué)成分，二萜類成分中冬凌草甲素和冬凌草乙素研究最多。冬凌草甲素呈淡黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)248~250 ℃，微溶于水，溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等。冬凌草乙素在常溫常壓下呈白色結(jié)晶粉末狀，溶于甲醇、乙醇，微溶于石油醚，幾乎不溶于水，在室溫下穩(wěn)定性較好。藥理試驗(yàn)表明，冬凌草具有清熱、解毒、消炎等作用，如冬凌草醇劑對(duì)金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌有明顯的抑制作用以及抗炎、免疫增強(qiáng)作用；冬凌草對(duì)治療咽喉腫痛、扁桃體炎、蛇蟲(chóng)咬傷等具有很好的作用，此外具有較好的抗癌、抗腫瘤活性，對(duì)食管癌、賁門(mén)癌有很好的療效，且毒性較低[10-11]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于冬凌草的抗菌活性研究范圍并不廣泛，主要集中在提取物[3，12]方面，關(guān)于抗菌活性成分的研究很少，主要研究了冬凌草甲素、冬凌草乙素和水楊酸等對(duì)細(xì)菌及植物源真菌的抑制作用。李小霞[13]以7種植物源真菌為研究對(duì)象，對(duì)冬凌草提取物抑菌活性及抑菌機(jī)制進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)冬凌草提取物可能是通過(guò)破壞細(xì)胞膜通透性，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，從而使菌體生長(zhǎng)受到抑制。李高申等[14]通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素、阿魏酸和水楊酸對(duì)3種金黃色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性?？娪窦训萚15]對(duì)冬凌草甲素對(duì)嗜水氣單胞菌體外抑菌效果及作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對(duì)嗜水氣單胞菌具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌機(jī)制主要是通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性以及干擾蛋白質(zhì)代謝進(jìn)而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。糾敏等[16]對(duì)冬凌草甲素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素是通過(guò)改變菌體細(xì)胞膜的通透性、抑制菌體蛋白質(zhì)合成及代謝酶的活性從而發(fā)揮抑制作用。王大海等[17]研究表明，冬凌草甲素能夠抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)，主要是通過(guò)對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子的抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)的；冬凌草甲素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有很好的抑制作用，其對(duì)革蘭氏陰性菌的作用比革蘭氏陽(yáng)性菌的作用弱。許美秋[18]研究了冬凌草提取物對(duì)金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，其MIC為125 μg/mL，當(dāng)冬凌草提取物質(zhì)量濃度大于1 MIC時(shí)，能顯著抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成和胞外多糖的合成。冬凌草提取物的亞抑制質(zhì)量濃度可通過(guò)抑制菌體蛋白質(zhì)的表達(dá)從而降低其蛋白質(zhì)的表達(dá)量。宋發(fā)軍等[19]對(duì)巴東冬凌草水提物抑菌效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)巴東冬凌草水提物有廣譜抑菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均抑制，但對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。前期研究主要集中在金黃色葡萄球菌，鑒于此，為綜合利用冬凌草的藥效價(jià)值，以河南省濟(jì)源市冬凌草葉提取物為試樣，分析其對(duì)葵腸桿菌、地衣芽孢桿菌等幾種常見(jiàn)細(xì)菌的抑菌活性，為冬凌草葉提取物制備成抑菌制劑提供試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

冬凌草葉樣品采于河南濟(jì)源；大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠 膿 桿 菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門(mén)氏菌（Salmonella）、地 衣 芽 孢 桿 菌（Bacillus licheniformis）、葵 腸 桿 菌（Enterobacter cepacius）由西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗(yàn)儀器及設(shè)備相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)儀器及設(shè)備

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冬凌草葉提取物制備 冬凌草葉提取物采用回流提取法[20-24]制備。將干燥冬凌草葉粉碎，稱取粉碎的冬凌草葉20 g，放入回流裝置的提取瓶中，加入95%的乙醇500 mL，在78 ℃下回流提取1 h，過(guò)濾。以45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液回收乙醇，制得浸膏。浸膏經(jīng)電熱恒溫水浴鍋蒸發(fā)制成固體粉末。提取工藝流程如圖1所示。

圖1 冬凌草葉提取物制備工業(yè)流程

1.3.2 濾紙片制備 用打孔器將濾紙打成直徑8 mm的圓紙片，分裝為2組，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽鍋滅菌30 min，置37 ℃恒溫烘干備用。

1.3.3 LB培養(yǎng)基制備 稱取蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉15 g于950 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.0。加蒸餾水定容至1 L，加熱溶解瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽鍋滅菌30 min。

1.3.4 抑菌活性測(cè)定

1.3.4.1 菌懸液的制備 取出-80 ℃冰箱下凍存的7 種菌株，解凍，分別劃線接種在LB培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。待長(zhǎng)出單菌落，用滅菌牙簽挑取生長(zhǎng)較好的菌落于液體LB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)12 h（120 r/min、37 ℃），制得懸液，備用。

1.3.4.2 涂菌 取制備的供試金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門(mén)氏菌、葵腸桿菌、地衣芽孢桿菌和綠膿桿菌懸液，接種100 μL于平板培養(yǎng)基，涂布棒涂勻。

1.3.4.3 抑菌圈直徑測(cè)定 采用濾紙片法[25-27]測(cè)定抑菌圈直徑。取冬凌草葉乙醇提取物，用無(wú)菌純水復(fù)溶為0.161 g/mL。將滅菌干燥的濾紙片放入溶液中浸泡24 h，用無(wú)菌鑷取出，放置于含菌平板中心。同時(shí)以浸泡在蒸餾水中的濾紙片為空白對(duì)照組，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，取出觀察，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4 冬凌草葉乙醇提取率計(jì)算

對(duì)得到的試樣品進(jìn)行稱質(zhì)量，通過(guò)下式計(jì)算提取率：

2 結(jié)果與分析

2.1 冬凌草葉提取率

冬凌草葉提取率按照1.4中的公式進(jìn)行計(jì)算：

冬凌草葉提取率為8.05%。

2.2 冬凌草葉提取物對(duì)細(xì)菌活性的抑制

冬凌草葉乙醇提取物的抑菌活性定性分析是利用浸過(guò)冬凌草葉提取物的濾紙片，在含菌平板中擴(kuò)散，使其周?chē)?xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而形成透明的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈直徑判定提取物的抑菌效果，結(jié)果如圖2—8及表2所示。

圖2 冬凌草葉提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌作用

圖3 冬凌草葉提取物對(duì)葵腸桿菌的抑菌作用

圖4 冬凌草葉提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌作用

圖5 冬凌草葉提取物對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌作用

圖6 冬凌草葉提取物對(duì)地衣芽孢桿菌的抑菌作用

圖7 冬凌草葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用

圖8 冬凌草葉提取物對(duì)綠膿桿菌的抑菌作用

與空白組相比，冬凌草葉提取物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌5 種供試菌均有一定的抑菌作用，含菌平板均形成了明顯的透明圈，其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的透明圈相對(duì)較大，菌體生長(zhǎng)均勻；枯草芽孢桿菌和沙門(mén)氏菌所形成的透明圈大小其次，菌體生長(zhǎng)較為均勻；綠膿桿菌形成的透明圈較小，菌體生長(zhǎng)不均勻；葵腸桿菌和地衣芽孢桿菌沒(méi)有明顯透明圈形成。綜上，冬凌草葉提取物對(duì)大多數(shù)細(xì)菌有較明顯的生長(zhǎng)抑制作用，有望開(kāi)發(fā)成天然抑菌制劑。

由表2可知，當(dāng)冬凌草葉提取物質(zhì)量濃度為0.161 g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為21、16、13、23、17 mm。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感；10～15 mm為中度敏感；7～9 mm為低度敏感；小于7 mm為不敏感[28]。因此，本研究中上述5株供試菌對(duì)冬凌草葉乙醇提取物均呈現(xiàn)出中高度敏感性，葵腸桿菌、地衣芽孢桿菌對(duì)冬凌草葉提取物均不敏感。冬凌草葉提取物可以抑制大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌5株供試菌的生長(zhǎng)，且對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳。綜上，冬凌草葉提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌效果，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗菌活性整體上高于革蘭氏陰性菌，這與參考文獻(xiàn)[17]、[19]的報(bào)道一致。

表2 冬凌草葉提取物對(duì)7種菌的抑菌圈大小

3 結(jié)論與討論

隨著抗生素和磺酰胺及其他抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌對(duì)藥物的抵抗力不斷提高。因此，研發(fā)高效、廣譜和低副作用的藥物將成為預(yù)防和治療細(xì)菌感染類疾病的重中之重。研究發(fā)現(xiàn)，中藥或天然植物提取物可抑制或直接殺滅病原菌而不產(chǎn)生耐藥性，因此，抗菌中藥逐步成為研究熱點(diǎn)[29]。前期研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素藥理作用廣泛，可以抑制多種細(xì)菌如金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖[3，30-32]。本研究主要對(duì)冬凌草葉活性物質(zhì)的抑菌效果進(jìn)行探索，以促進(jìn)冬凌草葉更為全面的開(kāi)發(fā)利用。

本研究探索了冬凌草葉提取物對(duì)7種細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)冬凌草葉提取物作用質(zhì)量濃度為0.161 g/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，對(duì)葵腸桿菌和地衣芽孢桿菌沒(méi)有抑菌活性。冬凌草葉提取物對(duì)不同細(xì)菌的抑制效果有較明顯差異。冬凌草葉提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)抑制程度整體上高于革蘭氏陰性菌，這主要是由于不同細(xì)菌細(xì)胞壁化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)上的差異。革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁是由多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的肽聚糖和磷壁酸組成，胞外沒(méi)有脂膜，冬凌草葉提取物的有效成分可以相對(duì)容易地滲透進(jìn)入，對(duì)生物膜發(fā)揮清除和形成抑制作用，致使膜壁分離，形成空腔，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁不含磷壁酸，只含單層肽聚糖，且肽聚糖外覆著1 層脂膜，由于脂膜的存在，冬凌草葉提取物水溶性成分相對(duì)不易進(jìn)入。因此，冬凌草葉提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有更顯著的抑制作用。冬凌草葉提取物對(duì)多種細(xì)菌有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，可作為植物源天然抑菌劑，安全性高，而且抑菌效果佳，可以考慮逐步取代抗生素類藥物，減少抗生素濫用現(xiàn)象。

細(xì)胞膜保護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，可與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交換。冬凌草提取物使細(xì)胞膜的形成受到抑制，通透性增加，細(xì)胞質(zhì)外流，嚴(yán)重影響菌體的新陳代謝活動(dòng)[33]。有研究表明，冬凌草甲素的抑菌機(jī)制主要通過(guò)破壞菌體形態(tài)，改變細(xì)胞膜的通透性以及引起細(xì)菌的代謝紊亂來(lái)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[13，15]。冬凌草葉提取物對(duì)細(xì)菌的生物膜有清除和抑制形成作用，可抑制胞外多糖合成[18]。目前，對(duì)于冬凌草葉提取物抑菌機(jī)制的研究尚不充分，下一步將探明冬凌草葉提取物對(duì)不同病原菌的抑菌活性和抑菌機(jī)制。