許思楠，郭劍秋，張濟(jì)明，朱效寧，劉萍，王彥娜，常秀麗，鄔春華，周志俊

復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院/公共衛(wèi)生安全教育部重點實驗室，上海 200032

鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一類廣泛使用的人工合成有機(jī)化合物［1］，根據(jù)其相對分子質(zhì)量和化學(xué)性質(zhì)分為低分子量PAEs（low molecular weight phthalate，LMWP，分子量＜250）和高分子量PAEs（high molecular weight phthalate，HMWP，分子量＞250）。LMWP主要應(yīng)用于化妝品、個人護(hù)理用品、香水和藥品；HMWP在塑料食品包裝袋、玩具、建筑材料中廣泛存在。其中，個人護(hù)理用品是人群暴露于PAEs的首要來源。由于PAEs在塑料聚合體中以非共價鍵的方式存在，因此塑料制品中PAEs會不斷逸出至環(huán)境中，可在水、大氣、土壤等環(huán)境介質(zhì)中廣泛檢出［2］。

PAEs 可以通過消化道、呼吸道、皮膚［3］等途徑進(jìn)入人體。PAEs 進(jìn)入人體后迅速代謝，代謝物大部分經(jīng)尿液排出體外，因此采用尿液作為生物監(jiān)測樣本進(jìn)行PAEs 暴露評估以反映人群暴露水平［4］。PAEs 具有內(nèi)分泌干擾作用，動物實驗研究發(fā)現(xiàn)PAEs 會通過干擾甲狀腺功能［5］、過氧化物酶受體家族（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）激活［6］、鈣穩(wěn)態(tài)［7］等影響健康。兒童處于快速生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，代謝功能尚未發(fā)育完全，對環(huán)境污染物暴露更為易感，特別是嬰幼兒期兒童由于手口行為多、呼吸帶低及單位體重攝入膳食多等原因，暴露于PAEs的機(jī)會較多，且暴露水平較高［8］。目前流行病學(xué)研究報道PAEs暴露與幼兒神經(jīng)發(fā)育不良、認(rèn)知行為問題有關(guān)［9］，但結(jié)論尚不一致。本研究通過檢測尿樣中10 種PAEs 代謝物評估2 歲幼兒的PAEs 暴露負(fù)荷，同時使用“Gesell 量表0～3 歲智力發(fā)育診斷量表［10］（后簡稱Gesell 量表）”評估幼兒神經(jīng)發(fā)育狀況，探究PAEs 暴露與低齡兒童神經(jīng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)，為保護(hù)兒童健康提供科學(xué)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2009—2010年，課題組在江蘇省射陽縣某婦產(chǎn)科醫(yī)院建立“射陽小型出生隊列”開展研究［11］，于2011年繼續(xù)隨訪隊列中的2 歲幼兒共405 人。隨訪內(nèi)容包括問卷調(diào)查、幼兒尿液樣本采集以及兒童智力發(fā)育評估。排除尿液不足或缺失者66 人，神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)缺失者1 人，母親孕期患有妊娠期高血壓和妊娠期糖尿病5 人，雙胞胎2 人，本研究最終納入331 名兒童。兒童監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書，并協(xié)助完成相關(guān)調(diào)查。該項目獲得復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理審查委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IRB#2021-02-0875）。

1.2 問卷調(diào)查

采用課題組自行編制的調(diào)查問卷，由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員通過面對面詢問方式向兒童監(jiān)護(hù)人采集信息。問卷調(diào)查內(nèi)容主要包括：疾病史、社會人口學(xué)信息、居住環(huán)境信息和可能接觸PAEs 的行為和生活習(xí)慣。

1.3 神經(jīng)發(fā)育評估

2 歲幼兒智力和神經(jīng)行為發(fā)育的評估使用Gesell量表，該量表在國內(nèi)廣泛用于評估兒童神經(jīng)智力發(fā)育。Gesell 量表共有28 個條目，對兒童動作能區(qū)、應(yīng)物能區(qū)、言語能區(qū)、應(yīng)人能區(qū)的神經(jīng)發(fā)育水平進(jìn)行評估。經(jīng)過年齡校正計算各能區(qū)的發(fā)育商（development quotient，DQ）和總DQ平均分，DQ評分越高代表幼兒的神經(jīng)發(fā)育狀況越好?？侱Q平均分≥85，表示幼兒神經(jīng)發(fā)育正常；總DQ 平均分＜84，表示幼兒神經(jīng)發(fā)育遲緩。本研究由經(jīng)培訓(xùn)合格的上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院的4 位兒科醫(yī)生作為評估醫(yī)師獨立完成幼兒神經(jīng)發(fā)育量表評估，并記錄評估醫(yī)師編號信息作為模型協(xié)變量。

1.4 尿樣采集與PAEs檢測

在監(jiān)護(hù)人協(xié)助下，調(diào)查員在研究現(xiàn)場用15 mL 離心管（美國Corning）采集幼兒尿樣，立即轉(zhuǎn)移至-20℃低溫冰箱，并于1 周內(nèi)采用冷鏈轉(zhuǎn)移至實驗室保存于-80℃超低溫冰箱中。

本研究檢測幼兒尿中10 種PAEs 代謝物，分別為鄰苯二甲酸單甲酯（mono-methyl phthalate，MMP）、鄰苯二甲酸單乙酯（mono-ethyl phthalate，MEP）、鄰苯二甲酸單丁酯（mono-n-butyl phthalate，MBP）、鄰苯二甲酸單異丁酯（mono-iso-butyl phthalate，MiBP）、鄰苯二甲酸單芐基酯（mono-benzyl phthalate，MBzP）、鄰苯二甲酸單（3-羧基丙基）酯［mono-（3-carboxypropyl）phthalate，MCPP］、鄰苯二甲酸單（2-乙 基己基）酯［mono-（2-ethylhexyl） phthalate，MEHP］、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-羥己基）酯［mono-（2-ethyl-5-hydroxy-hexyl） phthalate，MEHHP］、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-氧己基）酯［mono-（2-ethyl-5-oxo-hexyl） phthalate，MEOHP］、鄰苯二甲酸單（5-羰基-2-己戊基）酯［mono-（2-ethyl-5-carboxy-pentyl）phthalate，MECPP］的質(zhì)量濃度。其中，MMP、MEP、MBP和MiBP 屬于LMWP；MBzP、MCPP、MEHP、MEHHP、MEOHP 和MECCP 屬于HMWP。此外，MEHP、MEHHP、MEOHP 和MECCP 均為鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］的代謝產(chǎn)物。

采用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）（Agilent 1290/6460，美國）進(jìn)行檢測［12］。尿樣解凍后加入β-葡萄糖苷酸酶溶液酶水解，經(jīng)固相萃取提取凈化得到洗脫液，洗脫液氮氣吹干后經(jīng)過復(fù)溶，超聲、渦旋振蕩、過濾等步驟后上機(jī)檢測。該方法MMP、MEP、MEOHP、MEHHP、MECPP 質(zhì)量濃度的檢出限均為0.1 μg·L-1，其余5 種代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度的檢出限均為0.2 μg·L-1；回收率為94.94%～117.81%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

尿中肌酐測定采用南京建成科技有限公司生產(chǎn)的血、尿肌酐測定試劑盒（除蛋白法）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)。

采用頻數(shù)和構(gòu)成比描述研究對象的社會人口學(xué)信息；使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述幼兒Gesell 量表各能區(qū)DQ評分情況。PAEs代謝物質(zhì)量濃度呈偏態(tài)分布，經(jīng)肌酐校正對數(shù)轉(zhuǎn)換后近似正態(tài)分布。采用幾何均數(shù)G、幾何標(biāo)準(zhǔn)差GSD和百分位數(shù)描述幼兒尿PAEs 暴露水平的分布情況，PAEs代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度低于檢出限時采用LOD/ 賦值。LMWP 總濃度以CLMWP表示，為MMP、MEP、MBP、MiBP濃度之和（單位為μmol·g-1）；HMWP 總濃度以CHMWP表示，為MBzP、MCPP、MEHP、MEHHP、MECPP、MEOHP濃度之和（單位為μmol·g-1）；DEHP總濃度（CDEHP）為MEHP、MEHHP、MECPP、MEOHP濃度之和（單位為μmol·g-1）；PAEs代謝物總濃度（CPAEs）為10種代謝物濃度之和（單位為μmol·g-1）。使用Mann-WhitneyU檢驗比較不同性別幼兒的DQ評分情況。

協(xié)變量的選擇根據(jù)既往文獻(xiàn)［4］或者與PAEs 暴露和神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)相關(guān)聯(lián)的信息。主要包括母親年齡、母親學(xué)歷、母親職業(yè)、家庭年收入、母乳喂養(yǎng)時長、兒童性別、被動吸煙狀況、居住地、評估醫(yī)師編號。采用廣義線性模型探究2 歲幼兒PAEs 暴露與Gesell量表各能區(qū)DQ 得分的關(guān)系，并進(jìn)行性別分層分析；采用廣義相加模型進(jìn)一步探究PAEs 暴露與Gesell 量表各能區(qū)DQ 得分的劑量反應(yīng)關(guān)系；使用方差膨脹因子診斷模型的多重共線性。此外，敏感性分析將2 歲幼兒尿雙酚A（Bisphenol A，BPA）、有機(jī)磷農(nóng)藥（organophosphate pesticides，OPs）以及鉛（Pb）、鎘（Cd）、汞（Hg）質(zhì)量濃度納入作為協(xié)變量檢驗?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)健性。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 基本信息

在研究納入的331 名2 歲幼兒中，男童189 名（57.1%），女童142 名（42.9%）。幼兒母親分娩年齡為（26.03±5.49）歲，39.0%的幼兒母親職業(yè)為家庭主婦，70.4%的幼兒母親受教育水平為初中及以下；75.8%的幼兒居住在集鎮(zhèn)和農(nóng)村地區(qū)；48.9%的幼兒存在被動吸煙情況；有83.1%、95.2%、60.4%的幼兒存在使用塑料奶瓶、塑料玩具、塑料餐具的情況。本研究將納入與排除的幼兒基本特征進(jìn)行比較，結(jié)果顯示所有納入與排除對象在人口學(xué)因素上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見補(bǔ)充材料表S1。

2.2 幼兒尿中PAEs代謝物暴露水平

2歲幼兒尿液肌酐校正后PAEs代謝物暴露水平分布情況如表1所示，MEP、MiBP、MEHHP、MEOHP、MECCP的檢出率均為100%，其余5種PAEs代謝物的檢出率范圍為93.05%～99.70%。10種PAEs檢出值的幾何均值范圍為0.80～157.82 μg·g-1（以肌酐計，下同）；CPAEs中位值及四分位數(shù)范圍為3.05（1.54～6.25）μmol·g-1（以肌酐計，下同）。未經(jīng)肌酐校正的PAEs 質(zhì)量濃度見補(bǔ)充材料表S2。

表1 2歲幼兒尿液肌酐校正后PAEs代謝物檢出量分布（n=331）Table 1 Distribution of creatinine-adjusted urinary PAEs metabolites concentrations in toddlers aged 2 years (n=331)

2.3 幼兒神經(jīng)發(fā)育狀況

2 歲幼兒Gesell 量表總DQ 平均分的±s為97.58±8.11，各能區(qū)DQ 評分見表2。按性別分層后，男、女童總DQ 平均分分別為97.19±8.18 和97.87±8.41；除男童應(yīng)人能區(qū)DQ 評分低于女童外（P=0.003），其他能區(qū)DQ得分、總DQ 平均分以及神經(jīng)發(fā)育遲緩率在男女童間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 2 歲幼兒的Gesell量表各能區(qū)DQ 評分情況（n=331）Table 2 Distribution of Gesell Development Schedule DQ scores in toddlers aged 2 years (n=331)

2.4 幼兒PAEs 暴露水平與神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)的關(guān)聯(lián)

校正潛在混雜因素后，廣義線性模型分析PAEs暴露與神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)之間關(guān)聯(lián)的結(jié)果見表3，尿中MMP 經(jīng)肌酐校正濃度分別與幼兒應(yīng)物能區(qū)、應(yīng)人能區(qū)和總DQ 平均分呈負(fù)相關(guān)，其關(guān)聯(lián)系數(shù)b及其95%可信區(qū)間（CI）分別為-1.53（-2.77～-0.30）（P=0.015），-1.58（-2.86～-0.30）（P=0.015），-1.34（-2.53～-0.15）（P=0.027）；尿中MEHP 經(jīng)肌酐校正濃度與幼兒動作能區(qū)及總DQ 平均分呈正相關(guān)，b（95%CI）分別為2.03（0.35～3.71）（P=0.018），1.51（0.04～2.96）（P=0.045）；其余尿中PAEs 代謝產(chǎn)物濃度與幼兒Gesell 量表各能區(qū)DQ 評分的關(guān)聯(lián)均不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。廣義相加模型顯示僅MMP 與幼兒應(yīng)人能區(qū)DQ 得分的關(guān)系呈非線性關(guān)系（P＜0.05），結(jié)果見補(bǔ)充材料圖S1。

表3 2 歲幼兒尿液中經(jīng)肌酐校正的PAEs 代謝物水平與Gesell量表各能區(qū)DQ評分的關(guān)聯(lián)性分析Table 3 Associations between creatinine-adjusted urinary PAEs metabolites concentrations and Gesell Development Schedule DQ scores in 2-year-old toddlers

敏感性分析校正了同一尿樣中BPA、OPs、Pb、Cd、Hg濃度及混雜因素，PAEs 代謝物濃度與神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)的關(guān)聯(lián)方向和強(qiáng)度未發(fā)現(xiàn)明顯變化，結(jié)果見補(bǔ)充材料表S3。

性別分層分析發(fā)現(xiàn)，女童中（圖1）觀察到MMP分別與應(yīng)物能區(qū)、應(yīng)人能區(qū)以及總DQ平均分呈負(fù)相關(guān)（b=-1.94，95%CI：-3.81～-0.06，P=0.043；b=-2.80，95%CI：-4.73～-0.87，P=0.004；b=-1.88，95%CI：-3.69～-0.07，P=0.042）；而在男童中（圖2）發(fā)現(xiàn)MEHP 分別與動作能區(qū)評分及總DQ 平均分呈正相關(guān)（b=3.17，95%CI：1.01～5.33，P=0.004；b=2.15，95%CI：0.24～4.07，P=0.027）。

圖1 幼兒尿中MMP濃度與應(yīng)物能區(qū)（A）、應(yīng)人能區(qū)（B）DQ得分及總DQ平均分（C）關(guān)系的性別分層分析Figure 1 Associations of urinary MMP concentration with adaptive (A),personal-social (B),and total average (C) DQ scores in sex-stratified analysis

圖2 幼兒尿中MEHP濃度與動作能區(qū)DQ得分（A）及總DQ平均分（B）的關(guān)系的性別分層分析Figure 2 Associations of urinary MEHP concentration with motor (A)and total average (B) DQ scores in sex-stratified analysis

3 討論

PAEs具有內(nèi)分泌干擾作用，與兒童注意缺陷多動障礙、神經(jīng)發(fā)育遲緩有關(guān)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)研究對象尿中PAEs代謝物普遍存在；幼兒尿中MMP濃度與應(yīng)物、應(yīng)人能區(qū)得分及總DQ平均分呈負(fù)相關(guān)，MEHP濃度與動作能區(qū)得分及總DQ 平均分呈正相關(guān)；性別分層分析結(jié)果表明女童尿中MMP 濃度與幼兒神經(jīng)發(fā)育存在負(fù)向關(guān)聯(lián)，而男童尿中MEHP 濃度與幼兒神經(jīng)發(fā)育存在正向關(guān)聯(lián)。

本研究2 歲幼兒尿液中10 種PAEs 代謝產(chǎn)物檢出率為93.05%～100.00%，兒童尿肌酐校正CPAEs高于蔡秀秀等［14］于安徽馬鞍山隊列的研究結(jié)果。本研究幼兒尿中CLMWP水平高于CHMWP，這與Qian 等［15］對武漢2 歲幼兒檢測結(jié)果一致。本研究幼兒尿LMWP 肌酐校正濃度高于臺灣Ku等［16］同類研究結(jié)果；而HMWP肌酐校正濃度的中位值均低于該研究。課題組既往研究發(fā)現(xiàn)使用塑料奶瓶、塑料餐具可能會增加幼兒鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DiBP）與DEHP 的暴露水平［4］；而個人護(hù)理產(chǎn)品是鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）和DEP 的主要暴露源，占其總暴露量50%以上［17］。膳食途徑是中國人群DEHP 暴露的主要來源，占DEHP 總暴露量的50%以上；而膳食途徑僅占LMWP 總暴露量的10%以下［18］。LMWP 和HMWP應(yīng)用范圍和暴露途徑不同，可能是造成以上研究差異的原因。

本研究觀察到幼兒尿中MMP 濃度與兒童應(yīng)物能區(qū)、應(yīng)人能區(qū)和總DQ 評分存在負(fù)相關(guān)，性別分層結(jié)果觀察到MMP 僅與女童存在上述關(guān)聯(lián)。波蘭的橫斷面研究發(fā)現(xiàn)7 歲兒童尿中MMP 濃度與優(yōu)勢與困難量表中總困難評分和數(shù)學(xué)能力評分存在正向關(guān)聯(lián)；同時MMP 與智力與發(fā)展量表固定IQ 評分呈負(fù)相關(guān)，表明MMP 暴露可能與學(xué)齡兒童神經(jīng)發(fā)育受損有關(guān)［19］。Dong等［20］的研究發(fā)現(xiàn)9月齡嬰兒哺乳期MMP暴露僅為女嬰溝通能力發(fā)育遲緩的危險因素，本研究結(jié)果與之一致。本研究還觀察到幼兒尿中MEHP 濃度與兒童動作能區(qū)和總DQ 評分呈正相關(guān)；性別分層結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEHP 僅與男童動作能區(qū)評分及DQ 平均分呈正相關(guān)。Qian 等［15］武漢2 歲幼兒研究觀察到孕期MEHP 平均暴露水平也僅與男童貝利嬰幼兒發(fā)育量表運動發(fā)展指數(shù)呈正相關(guān)；本研究結(jié)果與以上研究一致。LMWP與HMWP 誘導(dǎo)激活或調(diào)節(jié)PPAR 通路時效力不同［21］，此外，LMWP 與HMWP 的暴露來源及水平不同，也可能是MMP 與MEHP 對幼兒神經(jīng)發(fā)育效應(yīng)結(jié)果不一致的原因，但這些發(fā)現(xiàn)需要更多的流行病學(xué)證據(jù)證明。

PAEs作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有抗雄激素作用并可干擾甲狀腺激素水平，而甲狀腺激素和性類固醇激素在幼兒生命早期大腦發(fā)育起著關(guān)鍵作用［13］。動物實驗表明，PAEs 抑制胚胎合成睪酮，使得下丘腦-垂體-性腺軸的組織和功能調(diào)節(jié)異常，且睪酮、雌二醇在哺乳動物受體通路存在性別差異［22］，DEHP 及其代謝產(chǎn)物MEHP 可以影響大鼠甲狀腺素合成、調(diào)節(jié)和作用功能［5］。流行病學(xué)研究表明PAEs 暴露對兒童甲狀腺功能影響具有性別差異，主要表現(xiàn)為在女童甲狀腺素水平下降，而男童甲狀腺素水平上升［9］。生命早期暴露于PAEs 會干擾海馬功能與結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響幼兒內(nèi)在行為［23］。以上機(jī)制學(xué)研究可能是PAEs 對幼兒神經(jīng)發(fā)育影響具有性別差異的原因。

本次研究基于射陽小型出生隊列研究，信息收集較為完整；采取的PAEs 代謝產(chǎn)物檢測方法檢出限較低，能夠準(zhǔn)確評估兒童尿中PAEs 的暴露負(fù)荷。敏感性分析排除了同期其他可能神經(jīng)毒物的影響。但本研究依然存在一些局限性，首先，本研究設(shè)計仍屬于橫斷面研究，因果關(guān)系推斷能力受限，缺乏孕期PAEs 暴露數(shù)據(jù)，無法排除孕期PAEs 的長期影響作用；其次，PAEs 在體內(nèi)快速代謝主要經(jīng)尿液排出，生物半衰期較短［21］，尿中的PAEs 羥基化代謝產(chǎn)物常作為暴露的生物標(biāo)志，研究表明普通人群在無生活方式改變的情況下，PAEs 的暴露水平一般處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，較大樣本量可以減少暴露錯分偏倚，但研究結(jié)論外推時需謹(jǐn)慎。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)該農(nóng)村地區(qū)2 歲幼兒體內(nèi)PAEs類暴露普遍存在，MMP 與MEHP 暴露與Gesell 量表發(fā)展量表部分能區(qū)得分存在關(guān)聯(lián)，且存在性別差異。研究結(jié)果為公共衛(wèi)生政策和兒童衛(wèi)生保健措施提供科學(xué)依據(jù)。在未來的研究中擬開展多中心、長時間的隊列隨訪研究，拓展結(jié)論的外推性；增加影響兒童神經(jīng)發(fā)育的影響因素調(diào)查，如膳食情況等；開展多污染物共暴露的研究，在共暴露模型中探究PAEs 類對兒童神經(jīng)發(fā)育的影響。