張釗熊,韓 強(qiáng),劉樹(shù)業(yè)

張釗熊,劉樹(shù)業(yè),天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津市重癥疾病體外生命支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心,天津市肝膽疾病研究所 天津市300170

韓強(qiáng),中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院及附屬第一醫(yī)院病理科 遼寧省沈陽(yáng)市110000

0 引言

癌癥是全世界發(fā)病率和死亡率的主要原因,給社會(huì)造成巨大的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1].目前多種不同腫瘤的生存率仍不理想,消化系統(tǒng)腫瘤是導(dǎo)致中國(guó)腫瘤患者死亡的主要原因之一[2].大樣本、高通量和多腫瘤數(shù)據(jù)對(duì)我們找到致癌的關(guān)鍵基因十分必要.一些醫(yī)學(xué)公共數(shù)據(jù)庫(kù)如TCGA (The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)提供了豐富的組學(xué)數(shù)據(jù),使我們?cè)诓煌M學(xué)層面進(jìn)行探索成為可能.

越來(lái)越多的研究關(guān)注到腫瘤免疫和預(yù)后標(biāo)志物的探索上.例如,Ye等[3]發(fā)現(xiàn)CD96參與多種免疫應(yīng)答,調(diào)控免疫細(xì)胞浸潤(rùn),并影響各種癌癥類型的惡性特性.另有研究報(bào)道FOXD1可能為口腔鱗狀細(xì)胞癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物和抗耐藥治療靶點(diǎn)[4].腫瘤免疫治療和靶向藥物治療是腫瘤治療的重要手段,但目前對(duì)腫瘤免疫治療和靶向藥物治療中出現(xiàn)的一些問(wèn)題尚未完全闡明.

PDE2A基因(phosphodiesterase 2A),中文名為磷酸二酯酶2A,此基因位于染色體11q13.4上,屬于磷酸水解酶家族.PDE2A基因突變可引起不同的遺傳病包括綜合征性陣發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙和非典型Rett綜合征[5,6].此外,有研究提示PDE2A在惡性黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲中發(fā)揮重要作用[7].然而,PDE2A基因在消化系統(tǒng)腫瘤中尚未見(jiàn)報(bào)道.本研究中,我們探索了PDE2A在不同腫瘤類型中的表達(dá)情況.此外,我們探索了PDE2A表達(dá)與5種不同消化系統(tǒng)腫瘤(肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌)預(yù)后和免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性,以期為消化系統(tǒng)腫瘤的診治提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 (1)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/);(2)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/);(3)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index);(4)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(http://timer.cistrome.org/);(5)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://stringdb.org/).

1.2 方法

1.2.1 基因表達(dá)分析:通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)獲取PDE2A基因在不同腫瘤中的相對(duì)表達(dá)水平.此外,采用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)(http://timer.cistrome.org/)分析PDE2A在不同癌組織和正常癌旁組織的表達(dá)情況.利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)探索PDE2A基因在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌不同病理分期的表達(dá)情況.

1.2.2 蛋白表達(dá)分析:采用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)探索PDE2A蛋白在不同消化系統(tǒng)腫瘤和正常癌旁組織中的表達(dá)水平.

1.2.3 生存預(yù)后分析:利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)分析PDE2AmRNA表達(dá)對(duì)肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌患者預(yù)后的影響.

1.2.4 免疫浸潤(rùn)分析:通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中的“Immune association”模塊探索PDE2A與5種不同消化系統(tǒng)腫瘤免疫浸潤(rùn)程度的相關(guān)性,包括CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞.

1.2.5 遺傳突變分析:通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.cbioportal.org/)的“Cancer types summary”模塊分析PDE2A基因在所有TCGA腫瘤類型的突變類型和拷貝數(shù)改變(Copy number alteration,CNV)信息.此外,利用“Mutations”模塊分析PDE2A基因在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌中的遺傳突變信息.

1.2.6 蛋白相互作用分析:利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)探索PDE2A的潛在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理腫瘤組和正常組表達(dá)數(shù)據(jù)兩組比較采用Wilcoxon檢驗(yàn).腫瘤患者的生存分析采用COX回歸分析.免疫分析采用Spearman相關(guān)分析.P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1PDE2A基因在不同腫瘤中的表達(dá) 我們通過(guò)HPA數(shù)據(jù)集分析了PDE2A基因在不同腫瘤組織中的表達(dá)(圖1).此外,我們進(jìn)一步分析了PDE2A在不同腫瘤組織和正常癌旁組織中的表達(dá),TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果提示PDE2A基因在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌組織中表達(dá)顯著低于正常癌旁組織(圖2).最后,我們通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析了不同消化系統(tǒng)腫瘤不同病理分期中PDE2A基因的表達(dá)(圖3A-E).

圖1 PDE2A在不同腫瘤中的表達(dá).

圖2 TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中不同腫瘤類型PDE2A基因的表達(dá)水平.

圖3 基于UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析PDE2A基因在不同病理分期的表達(dá).

2.2 PDE2A蛋白在不同消化系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá) 我們通過(guò)分析HPA數(shù)據(jù)庫(kù)探索了PDE2A蛋白在不同消化系統(tǒng)中的表達(dá)情況.HPA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果提示PDE2A蛋白在肝癌、胃癌、胰腺癌和結(jié)腸癌組織中呈陰性表達(dá)或低表達(dá),在正常肝組織、胃組織、胰腺組織和結(jié)直腸組織中呈中等表達(dá)或高表達(dá)(圖4A-D).

圖4 HPA數(shù)據(jù)集中PDE2A的蛋白表達(dá).A:PDE2A在肝癌及正常肝組織中的蛋白表達(dá);B:PDE2A在胃癌及正常胃組織中的蛋白表達(dá);C:PDE2A在胰腺癌及正常胰腺組織中的蛋白表達(dá);D:PDE2A在結(jié)腸癌及正常結(jié)直腸組織中的蛋白表達(dá).

2.3 PDE2A在不同消化系統(tǒng)腫瘤中的預(yù)后價(jià)值 為了進(jìn)一步研究PDE2A在不同消化系統(tǒng)腫瘤中的預(yù)后價(jià)值,我們分析了GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù).結(jié)果提示PDE2A高表達(dá)的肝癌和胰腺癌患者較PDE2A低表達(dá)的患者預(yù)后良好(圖5A、圖5C).然而PDE2A高表達(dá)的胃癌患者較PDE2A低表達(dá)的患者預(yù)后差(圖5B).PDE2A表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌和食管癌患者預(yù)后無(wú)影響(圖5D、圖5E).

圖5 PDE2A基因表達(dá)與胃腸道腫瘤生存預(yù)后的關(guān)系.A:肝癌;B:胃癌;C:胰腺癌;D:結(jié)腸癌;E:食管癌.

2.4 PDE2A表達(dá)與消化系統(tǒng)腫瘤免疫浸潤(rùn) 為了探索PDE2A表達(dá)與肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌不同免疫細(xì)胞的相關(guān)性,我們分析了TIMER數(shù)據(jù)庫(kù).結(jié)果提示PDE2A表達(dá)與肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌不同免疫細(xì)胞如CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)(圖6A-E).

圖6 PDE2A表達(dá)與消化系統(tǒng)腫瘤免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性.A:肝癌;B:胃癌;C:胰腺癌;D:結(jié)腸癌;E:食管癌.

2.5PDE2A基因在消化系統(tǒng)腫瘤中的遺傳突變分析 我們通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析了PDE2A基因在不同腫瘤中的遺傳突變信息,結(jié)果提示PDE2A基因在不同腫瘤中存在結(jié)構(gòu)變異、突變及染色體缺失等遺傳改變(圖7).我們進(jìn)一步通過(guò)“Mutations”模塊分析了PDE2A基因在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌中的突變情況,結(jié)果提示PDE2A基因胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌及食管癌中存在錯(cuò)義突變等遺傳改變(圖8B-E),然而在肝癌中無(wú)基因突變發(fā)生(圖8A).

圖7 利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析不同TCGA腫瘤中PDE2A基因的遺傳突變特征.

圖8 利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析消化系統(tǒng)腫瘤中PDE2A基因的遺傳突變特征.A:肝癌;B:胃癌;C:胰腺癌;D:結(jié)腸癌;E:食管癌.

2.6 PDE2A的潛在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 為了探索PDE2A的潛在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),我們分析了STRING數(shù)據(jù)庫(kù).結(jié)果提示PDE2A的潛在相互作用蛋白包括ADCY10、GUCY1A2、APRT和HPRT1等(圖9).

圖9 PDE2A的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò).

3 討論

目前針對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤的治療方法主要包括外科手術(shù)、化療和免疫治療[8].晚期消化系統(tǒng)腫瘤患者的生存率仍較低,從分子角度尋找更好的消化系統(tǒng)腫瘤免疫治療標(biāo)志物和診治標(biāo)志物十分必要.Kang等[9]發(fā)現(xiàn)LIMK1可促進(jìn)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移且可能是胃癌治療的靶點(diǎn).另一研究提示血清外泌體中的miR-638可能為肝癌重要的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物[10].Peng等[11]發(fā)現(xiàn)CMTM6和PD-L1共表達(dá)與結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境激活和預(yù)后良好相關(guān).上述研究對(duì)我們明確消化系統(tǒng)腫瘤的免疫機(jī)制和預(yù)后判斷提供了有力證據(jù),但我們對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤免疫和預(yù)后標(biāo)志物的研究仍不足.

目前已有多篇研究發(fā)現(xiàn)PDE2A參與不同腫瘤的病理進(jìn)展.不同研究發(fā)現(xiàn)PDE2A可作為宮頸腺癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物[12,13].另一學(xué)者的結(jié)果提示長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01537通過(guò)促進(jìn)PDE2A表達(dá)影響溫伯格效應(yīng),進(jìn)而影響肺癌的能量代謝[14].以上研究均提示PDE2A在腫瘤中發(fā)揮重要作用,然而PDE2A在消化系統(tǒng)腫瘤如肝癌等尚未見(jiàn)報(bào)道.

我們的研究首次探索了PDE2A在消化系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá),基因分析結(jié)果提示PDE2A基因和蛋白在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌患者中表達(dá)低于正常癌旁組織.然而,Ding等的研究與我們的發(fā)現(xiàn)相反.他們的結(jié)果提示PDE2A在宮頸癌組織和HeLa細(xì)胞中呈高表達(dá)[12].我們認(rèn)為導(dǎo)致PDE2A在不同腫瘤中表達(dá)差異的原因可能為不同腫瘤間存在異質(zhì)性.此外,我們還發(fā)現(xiàn)PDE2A高表達(dá)的肝癌和胰腺癌患者預(yù)后良好,然而PDE2A高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較差.我們認(rèn)為有如下原因:首先,納入研究患者的數(shù)量不夠大,其次,其他因素可能影響了腫瘤患者的預(yù)后.

免疫治療在消化系統(tǒng)腫瘤如肝癌和腸癌中取得了顯著效果[15,16].大量的證據(jù)表明,免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可影響腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā),是決定免疫治療反應(yīng)和臨床療效的重要因素[17].因此,越來(lái)越多的學(xué)者將研究重點(diǎn)關(guān)注到腫瘤的免疫方向.我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDE2A表達(dá)與肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌不同免疫細(xì)胞如CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞等呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān),提示PDE2A表達(dá)水平可反應(yīng)消化道腫瘤的免疫狀態(tài).腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞,具有抗腫瘤功能.其中CD8+T淋巴細(xì)胞能特異性識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體抗原,廣泛應(yīng)用于腫瘤靶向治療[18].我們的結(jié)果可能為消化系統(tǒng)腫瘤免疫治療的研究提供潛在依據(jù).我們同樣分析了PDE2A基因在消化系統(tǒng)腫瘤中的遺傳突變,結(jié)果提示PDE2A基因胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌及食管癌中存在錯(cuò)義突變等遺傳改變.上述結(jié)果可能為消化系統(tǒng)疾病靶向藥物的開(kāi)發(fā)提供潛在線索.

然而,我們的研究仍有一些不足.首先,我們的研究主要是基于數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘,我們擬開(kāi)展更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).其次,PDE2A在不同消化系統(tǒng)腫瘤如肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌中呈低表達(dá),但其低表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚.我們擬在后續(xù)研究探索PDE2A在消化系統(tǒng)腫瘤中的具體分子機(jī)制.

4 結(jié)論

綜上所述,本研究利用生物信息學(xué)方法分析了PDE2A基因在消化系統(tǒng)腫瘤預(yù)后及免疫浸潤(rùn)的臨床意義.我們發(fā)現(xiàn)PDE2A mRNA和蛋白在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌患者呈低表達(dá).此外,PDE2A表達(dá)與不同消化系統(tǒng)腫瘤的免疫浸潤(rùn)有關(guān).PDE2A高表達(dá)的肝癌和胰腺癌患者預(yù)后良好.PDE2A可能為潛在的消化系統(tǒng)腫瘤免疫治療和預(yù)后標(biāo)志物.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

消化系統(tǒng)腫瘤的預(yù)后尚不理想.生物標(biāo)志物是腫瘤研究的重要方向之一,探索新的消化系統(tǒng)腫瘤相關(guān)標(biāo)志物十分必要.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

通過(guò)生物信息學(xué)探索PDE2A在消化系統(tǒng)腫瘤的潛在臨床意義.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探究PDE2A是否與消化系統(tǒng)腫瘤免疫浸潤(rùn)有關(guān),探索PDE2A是否影響消化系統(tǒng)腫瘤患者的預(yù)后.

實(shí)驗(yàn)方法

通過(guò)生物信息學(xué)分析PDE2A在不同消化系統(tǒng)腫瘤中的mRNA及蛋白表達(dá).探索PDE2A對(duì)消化系統(tǒng)腫瘤患者預(yù)后的影響.分析PDE2A表達(dá)與消化系統(tǒng)腫瘤免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性.探索PDE2A在不同消化系統(tǒng)腫瘤的遺傳突變情況.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PDE2A基因的mRNA及蛋白在肝癌、胃癌和胰腺癌等消化系統(tǒng)腫瘤中呈低表達(dá).PDE2A高表達(dá)的肝癌和胰腺癌患者預(yù)后良好.PDE2A表達(dá)與不同消化系統(tǒng)腫瘤的免疫浸潤(rùn)有關(guān).PDE2A基因胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌及食管癌中存在錯(cuò)義突變等遺傳改變.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

PDE2A基因在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌患者呈低表達(dá)且與免疫浸潤(rùn)有關(guān).

展望前景

PDE2A基因可能為潛在的消化系統(tǒng)腫瘤免疫治療和預(yù)后標(biāo)志物.