張艷英 王曉剛 支曉慧

作者單位：1 臨沂市精神衛(wèi)生中心藥學(xué)部，山東 臨沂 276004

2 山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 臨沂 276004

糖尿病患者因胰島素分泌減少或胰島素抵抗使機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下，易導(dǎo)致內(nèi)臟（尤其是心臟）功能異常，出現(xiàn)心肌細(xì)胞代謝紊亂、心肌損傷、心肌肥大、心肌纖維化等病理生理改變，可引起左心室肥厚、心臟舒縮功能障礙，最終進(jìn)展為終末期心力衰竭[1]。糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等曾被證實(shí)參與其發(fā)生發(fā)展[2，3]。

輪葉黨參為桔?？泣h參屬多年生藤本植物，主要含有揮發(fā)油類、生物堿類及三萜皂苷等成分，具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用[4]。輪葉黨參的皂苷組分可以抑制免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；三萜類化合物具有一定的抗炎活性，其抗炎作用是通過(guò)其對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[5]?，F(xiàn)通過(guò)研究輪葉黨參在糖尿病心肌病大鼠模型中的作用，進(jìn)一步探討其心肌保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑4 周齡雄性SPF 級(jí)大鼠，體質(zhì)量100～120g，購(gòu)自濟(jì)南蓬月實(shí)驗(yàn)動(dòng)物育種有限公司[SCXK（Lu）20140007]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照《保養(yǎng)和使用指南》進(jìn)行，對(duì)動(dòng)物的處理均已得到動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。普通飼料和高脂飼料購(gòu)自北京蕙特比科技有限公司。

鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）試劑盒由上海創(chuàng)賽科技有限公司提供；丙二醛（Malonaldehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（BC0025）由北京索萊寶科技有限公司提供；ROS 測(cè)定試劑盒（E004-1-1）及超氧化物歧化酶 （Superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒（A001-3-2）由南京建成生物工程研究所提供；胞漿蛋白提取試劑盒（KTP3001）由武漢艾美捷科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 輪葉黨參總皂苷制備 輪葉黨參經(jīng)過(guò)水提、乙醇沉淀、石油醚以及乙酸乙酯萃取、D-101 大孔吸附樹(shù)脂過(guò)柱、乙醇、蒸餾水洗脫等步驟得到輪葉黨參總皂苷（純度≥90%）。

1.2.2 模型創(chuàng)建及動(dòng)物分組 領(lǐng)取符合要求的90 只大鼠，隨機(jī)選取30 只接受普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的作為正常對(duì)照組，其他60 只接受高糖高脂飼料（添加20%蔗糖和20%豬油）喂養(yǎng)，任選其中30 只作為模型對(duì)照組，其余30 只作為輪葉黨參組。正常對(duì)照組生理鹽水灌胃、模型對(duì)照組生理鹽水灌胃、輪葉黨參組給予輪葉黨參總皂苷（80mg·kg-1·d-1）灌胃，給藥8周。8 周后，高糖高脂喂養(yǎng)的大鼠觀察到胰島素抵抗后在腹膜內(nèi)注射鏈脲佐菌素（STZ）40mg/kg。72h 和7d 后測(cè)定空腹血糖，兩次空腹血糖值≥11.6mmol/L為糖尿病大鼠。

1.3 觀察指標(biāo)心臟組織勻漿，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)心肌組織勻漿上清液中TNF-α、SOD 及MDA 的含量，采用Western、IP 細(xì)胞裂解液提取蛋白，聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳檢測(cè)可溶性細(xì)胞間粘附分子-1（sICAM-1）和可溶性血管細(xì)胞粘附分子-1（sVCAM-1）的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌組織中SOD、MDA、TNF-α 含量比較與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及輪葉黨參組SOD 活性均明顯降低，但輪葉黨參組SOD 活性高于模型對(duì)照組（P<0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及輪葉黨參組MDA 和TNF-α 含量均明顯升高，但輪葉黨參組低于模型對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組心肌組織中SOD、MDA、TNF-α 含量比較（±s）

表1 各組心肌組織中SOD、MDA、TNF-α 含量比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與輪葉黨參組比較，△P<0.05

分組動(dòng)物數(shù)SOD(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)TNF-α(pg/mg prot）正常對(duì)照組3032.00±7.221.28±0.507.50±3.19模型對(duì)照組3011.63±5.19*△ 5.36±6.01*△ 18.56±7.80*△輪葉黨參組3022.33±14.80* 4.54±0.61*9.09±0.91*

2.2 各組心肌組織中sICAM-1、sVCAM-1 含量比較與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及輪葉黨參組sICAM-1、sVCAM-1 含量均明顯升高，但輪葉黨參組低于模型對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組心肌組織中sICAM-1、sVCAM-1 含量比較（±s，ng/ml）

表2 各組心肌組織中sICAM-1、sVCAM-1 含量比較（±s，ng/ml）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與輪葉黨參組比較，△P<0.05

分組動(dòng)物數(shù)sICAM-1 sVCAM-1正常對(duì)照組30663.32±103.23467.35±73.45模型對(duì)照組301221.24±213.23*△876.25±53.26*△輪葉黨參組30789.22±93.23*576.17±45.22*

3 討論

糖尿病心肌病變易引發(fā)心臟舒縮功能障礙，嚴(yán)重者可導(dǎo)致終末期心力衰竭，嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生活質(zhì)量，是導(dǎo)致患者死亡的重要因素，目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚。代謝失衡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等都曾被證實(shí)參與心肌病變的發(fā)生與發(fā)展，其中炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞及眾多炎癥細(xì)胞可分泌促纖維化因子和炎癥因子，引起心肌細(xì)胞損傷，刺激心肌纖維化，并通過(guò)多種復(fù)雜炎癥信號(hào)引起心臟異常。在糖尿病合并心衰患者及糖尿病心肌病的動(dòng)物模型中，白介素-6（Interleukin 6，IL-6）、TNF-α、VCAM-1 及ICAM-1 等多種細(xì)胞因子的表達(dá)均明顯升高[6]。疾病早期，炎癥反應(yīng)是機(jī)體應(yīng)對(duì)高糖損害的一種保護(hù)性反應(yīng)，若此種損害持續(xù)存在，炎癥反應(yīng)慢性化，則導(dǎo)致心肌細(xì)胞受損、心肌重塑、心肌纖維化，最終導(dǎo)致心臟功能異常[6]。上述研究均表明，炎癥反應(yīng)在糖尿病心肌病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要參與者。

輪葉黨參為多年生藤本植物，含有生物堿類及三萜皂苷等成分，具有顯著的抗炎作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，黨參水提液及單體成分Lancemaside A 可通過(guò)靶向LPS/TLR4 復(fù)合物來(lái)抑制炎癥反應(yīng)[7]，還可通過(guò)抑制NF-κB 的活性改善結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀[8]。Xu 等[9]發(fā)現(xiàn)從輪葉黨參中分離出的三帖皂苷具有顯著的抗炎作用。Byeon 等[10]研究發(fā)現(xiàn)輪葉黨參的皂素餾分，可顯著抑制免疫細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

VCAM-1、ICAM-1 及TNF-α 均可作為炎性標(biāo)記物，VCAM-1 及ICAM-1 由白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞等表達(dá)，是免疫球蛋白超家族成員，可參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、活化等過(guò)程。sICAM-1 及sVCAM-1是由ICAM-1 及VCAM-1 的膜外段脫落而形成。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下這些粘附分子的異常表達(dá)，可通過(guò)參與介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管通透性增加及血栓形成等，進(jìn)而影響糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展[11，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及輪葉黨參組sICAM-1、sVCAM-1 及TNF-α 含量均明顯升高（P<0.05）；但與模型對(duì)照組相比，輪葉黨參組sICAM-1、sVCAM-1、MDA 及TNF-α 含量明顯下降（P<0.05）。

慢性持續(xù)高血糖狀態(tài)可致活性氧自由基生成增加，激活細(xì)胞因子及炎癥相關(guān)因子，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白變性、細(xì)胞氧化損傷等。作為脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，MDA 的生成亦明顯增加。SOD 為抗氧化防御體系中主要抗氧化酶，具有顯著的抗氧化作用，可降低MDA 表達(dá)，提高心肌抗氧化水平。

本研究顯示，輪葉黨參可顯著提高SOD 活性，提高心肌抗氧化水平，減少M(fèi)DA 的表達(dá)，同時(shí)可顯著減少大鼠心肌細(xì)胞sICAM-1、sVCAM-1 及TNF-α 的表達(dá)，具有一定的心肌保護(hù)作用。