宋 揚(yáng)，于 鐳，梁宛楠，李 倩

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

星狀病毒（Astrovirus）是一類無囊膜、呈球形的單股正鏈病毒，基因組長(zhǎng)度在6.2 ～7.9 kb不等[1]。星狀病毒科根據(jù)感染宿主的不同可分為哺乳動(dòng)物屬和禽類星狀病毒屬，其中哺乳動(dòng)物屬根據(jù)宿主的不同又分為人星狀病毒、貓星狀病毒、豬星狀病毒、綿羊星狀病毒以及貂星狀病毒；禽類星狀病毒屬包括鴨星狀病毒（DAstV）、火雞星狀病毒（TAstV）、禽腎炎病毒（ANV）和雞星狀病毒（CAstV）[2]。2017年下半年以來，我國江蘇、山東、遼寧、安徽及河南等地區(qū)的養(yǎng)鵝場(chǎng)陸續(xù)暴發(fā)了一種以痛風(fēng)為主要癥狀的致死性傳染病。該病主要引起4～20日齡鵝消瘦、跛行和癱瘓，死亡率可達(dá)30%以上，剖檢表現(xiàn)為關(guān)節(jié)和內(nèi)臟器官的大量尿酸鹽沉積，且疾病的發(fā)生與鵝的品種、飼料配方、飼喂量等均無關(guān)[3]。多項(xiàng)研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)該病是由新型的鵝源星狀病毒（Goose astrovirus，GAstV）引起[4]。由于該病目前尚無有效的疫苗和抗體用于預(yù)防，因此給我國的養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

為有效控制該病的發(fā)生，本研究用哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心前期分離鑒定的GAstV-DT株制備滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋雞，采集高免雞蛋通過酸化水-辛酸法制備卵黃抗體，并對(duì)卵黃抗體的安全性及免疫效力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為GAstV卵黃抗體的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

GAstV-DT株，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心分離保存；1、3、4、7日齡健康易感雛鵝，11日齡健康易感鵝胚，購自哈爾濱市雙城區(qū)白長(zhǎng)順孵化場(chǎng)；18～22g清潔級(jí)小白鼠，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院；120～130日齡海蘭褐產(chǎn)蛋雞，購自哈爾濱巖鶴養(yǎng)雞專業(yè)合作社；醋酸鈉、冰醋酸、正辛酸、氯仿、聚乙二醇（6000）、硫酸銨，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 滅活疫苗的制備

取GAstV-DT株毒種，用生理鹽水進(jìn)行100倍稀釋，尿囊腔接種11日齡健康易感鵝胚，收獲24～168h死亡鵝胚尿囊液。將收獲的尿囊液（病毒含量≥10-5.0ELD50·0.2 mL-1）加入終濃度為0.2 %的甲醛溶液中，37℃滅活24h，滅活檢驗(yàn)合格后將病毒液與白油佐劑按1∶2比例混合，充分乳化制成滅活疫苗。

2.2 蛋雞免疫程序的優(yōu)化

將40只產(chǎn)蛋雞隨機(jī)分成A、B、C、D4組，每組10只。A組首次免疫0.5 mL滅活疫苗，在首免后的第21天和42天再次免疫滅活苗1.0 mL和1.5 mL。B組首次免疫1.0 mL滅活疫苗，在首免后的第21天和42天再次免疫滅活苗1.5 mL和2.0 mL。C組首次接種1.0 mL病毒液，之后與B組進(jìn)行相同的免疫。D組為陰性對(duì)照組，不進(jìn)行免疫。每組均采用胸部肌肉注射方式進(jìn)行免疫。在首次免疫后0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、60d、90d、120d、150d和180d收集雞蛋，制備卵黃抗體，進(jìn)行抗體中和效價(jià)的測(cè)定。

2.3 卵黃抗體的制備及檢測(cè)

將高免蛋（效價(jià)不低于1∶128）分別采用氯仿法、聚乙二醇法和飽和硫酸銨法制備卵黃抗體[5]，同時(shí)采用酸化水-辛酸法進(jìn)行卵黃抗體的制備，即將高免蛋浸入0.1%的二氯異氰尿酸鈉水溶液中消毒15min，去蛋殼分離卵黃。量取卵黃液體積，加入其8倍體積的醋酸緩沖液（0.12 mol·L-1，pH值5.0 ）充分?jǐn)嚢瑁{(diào)pH值5.2 ，靜置16h。取上清液加入終濃度為1.5%的正辛酸，室溫下靜置16h，取上清液，調(diào)pH值為7.2。上清液分別經(jīng)孔徑為1.0 μm和0.45 μm的濾器過濾，再經(jīng)截留分子量為100ku超濾膜包濃縮復(fù)水3次。濃縮液加入終濃度為0.05%甲醛溶液，室溫滅活24h，即為制備的卵黃抗體。將GAstV病毒液稀釋成200ELD50/0.2 mL，與等量2倍系列稀釋的待檢卵黃抗體混合，置37℃下作用1h。每個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種11日齡健康易感鵝胚5枚，每胚0.2 mL，同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照（接種同條件處理的病毒液和生理鹽水混合液）5枚，置37℃培養(yǎng)168h，記錄24～168h鵝胚的存活和死亡數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算卵黃抗體中和效價(jià)，并根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]對(duì)卵黃抗體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

2.4 卵黃抗體靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)

將卵黃抗體以單劑量（0.5 mL·只-1）頸部皮下接種1日齡易感雛鵝10只，同時(shí)設(shè)置相同數(shù)量的未注射雛鵝作為對(duì)照，觀察14d，觀察記錄雛鵝的注射部位變化、精神狀態(tài)及存活情況。

2.5 卵黃抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)相關(guān)性分析

取1日齡健康易感雛鵝80只，隨機(jī)分為A、B、C、D4組，每組20只。A～C組為免疫組，分別頸部皮下接種效價(jià)為1∶64、1∶128和1∶256的卵黃抗體，0.5 mL·只-1；D組為攻毒對(duì)照組，頸部皮下接種同等劑量的生理鹽水。接種抗體24h后，對(duì)照組和免疫組雛鵝頸部皮下接種GAstV-DT株病毒液，0.1 mL·只-1（含1000ELD50）。各組隔離飼養(yǎng)觀察10d，統(tǒng)計(jì)各組雛鵝的發(fā)病數(shù)，分析不同效價(jià)卵黃抗體與雛鵝攻毒保護(hù)的相關(guān)性。

2.6 卵黃抗體最小免疫劑量試驗(yàn)

取3日齡健康易感雛鵝100只，隨機(jī)分為5組，每組20只。A～D組為免疫組，分別按0.1 mL·只-1、0.25 mL·只-1、0.5 mL·只-1和1.0 mL·只-1接種卵黃抗體；E組為攻毒對(duì)照組。接種抗體24h后，對(duì)照組和免疫組雛鵝頸部皮下接種GAstV-DT株病毒液，0.1 mL·只-1（含1000ELD50），各組隔離飼養(yǎng)觀察10d，統(tǒng)計(jì)各組雛鵝的發(fā)病數(shù)，計(jì)算保護(hù)率。按相同的分組方法和免疫攻毒方式進(jìn)行4日齡和7日齡雛鵝的最小免疫劑量試驗(yàn)。

2.7 卵黃抗體免疫保護(hù)產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期試驗(yàn)

取1日齡雛鵝360只，隨機(jī)分為A、B2組，每組180只。A組為免疫組，頸部皮下接種抗體，0.5 mL·只-1；B組為攻毒對(duì)照組，頸部皮下接種相同劑量的生理鹽水。接種抗體后2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d和10d分別從對(duì)照組和免疫組中各隨機(jī)抽取雛鵝10只，頸部皮下接種GAs?tV-DT株病毒液，0.1 mL·只-1（含1000ELD50），攻毒后各組隔離飼養(yǎng)觀察10d，統(tǒng)計(jì)雛鵝發(fā)病數(shù)，計(jì)算保護(hù)率。

3 結(jié)果與分析

3.1 蛋雞免疫程序優(yōu)化

按不同免疫方案對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，分別測(cè)定各組蛋雞在免疫后0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、60d、90d、120d、150d和180d的卵黃抗體中和效價(jià)（見圖1）。結(jié)果顯示，首免7d后，A、B、C組抗體水平快速上升，免疫后49d抗體效價(jià)達(dá)到峰值8.8 lg、10.5 lg和8.2 lg，隨后效價(jià)緩慢下降，分別于免疫后150d、180d和120d降至7.0 lg以下。表明首次免疫滅活苗1.0 mL，首免后21d和42d再次免疫滅活苗1.5 mL和2.0 mL的免疫程序抗體峰值效價(jià)最高，有效抗體效價(jià)（7.0 lg以上）維持時(shí)間最長(zhǎng)，免疫效果最佳。

圖1 不同免疫程序免疫產(chǎn)蛋雞卵黃抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

3.2 卵黃抗體的制備及檢測(cè)

將4種不同方法制備的卵黃抗體分別進(jìn)行中和效價(jià)測(cè)定和SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，酸化水-辛酸法、聚乙二醇法、飽和硫酸銨法和聚乙二醇法制備卵黃抗體的中和效價(jià)分別為1∶445.7、1∶388.0 、1∶362.0 和1∶337.8 ，使用酸化水-辛酸法較其他3種方法獲得的卵黃抗體效價(jià)高。SDSPAGE電泳檢測(cè)中，酸化水-辛酸法和飽和硫酸銨法制備的卵黃抗體在67ku和23ku處有兩條目的條帶（重鏈和輕鏈），雜蛋白較少；聚乙二醇法和氯仿法有大量的雜蛋白條帶（見圖2），表明酸化水-辛酸法和飽和硫酸銨法制備的卵黃抗體純度更高。

圖2 不同方法制備的卵黃抗體SDS-PAGE電泳結(jié)果

3.3 卵黃抗體靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)

卵黃抗體以單劑量、單劑量重復(fù)和超劑量接種1日齡易感雛鵝，觀察期內(nèi)易感雛鵝100%健活，接種部位無紅腫、結(jié)節(jié)等不良反應(yīng)，精神狀態(tài)良好，行為、采食及飲水均未見異常，與對(duì)照雛鵝無可見差異。表明卵黃抗體安全性良好。

3.4 卵黃抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)相關(guān)性分析

將不同效價(jià)的卵黃抗體接種3日齡雛鵝，接種24h后攻毒，中和效價(jià)為1∶64、1∶128和1∶256的卵黃抗體對(duì)雛鵝的保護(hù)率分別為65%、80%和100%；攻毒對(duì)照組雛鵝發(fā)病率為95%（見表1）。該結(jié)果表明卵黃抗體中和效價(jià)與攻毒保護(hù)呈正相關(guān)關(guān)系，在抗體效價(jià)不低于1∶128時(shí)能對(duì)雛鵝產(chǎn)生有效保護(hù)。

表1 鵝星狀病毒卵黃抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)相關(guān)性結(jié)果

3.5 卵黃抗體最小免疫劑量試驗(yàn)

卵黃抗體分別按0.1 、0.25 、0.5 和1.0 mL·只-1的劑量注射3日齡雛鵝，24h后攻毒，接種3日齡雛鵝的保護(hù)率分別為55%、80%、90%和100%；接種4日齡雛鵝的保護(hù)率分別為50%、60%、85%和100%；接種7日齡雛鵝的保護(hù)率分別為45%、55%、80%和100%。試驗(yàn)中健康對(duì)照組雛鵝100%健活，攻毒組發(fā)病率均為80%以上（見表2）。

表2 鵝星狀病毒卵黃抗體最小免疫劑量測(cè)定結(jié)果

該結(jié)果表明卵黃抗體接種雛鵝能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用，抗體的最小免疫劑量為3日齡雛鵝0.25 mL·只-1，4日齡和7日齡雛鵝0.5 mL·只-1。

3.6 卵黃抗體免疫保護(hù)產(chǎn)生期和免疫持續(xù)期試驗(yàn)

卵黃抗體接種雛鵝后在不同時(shí)間段用GAstVDT株強(qiáng)毒對(duì)免疫雛鵝攻毒，結(jié)果顯示抗體接種后2h、4h和6h的保護(hù)率均低于80%；接種后8h的保護(hù)率為80%；接種后14h的保護(hù)率達(dá)100%并持續(xù)至接種后第4d，接種后第5d保護(hù)率開始下降，接種后第6d保護(hù)率降至70%（見圖4）。該結(jié)果表明，抗體免疫產(chǎn)生期為卵黃抗體接種后8h，免疫持續(xù)期為5d。

圖4 卵黃抗體注射雛鵝后不同時(shí)間攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

4 討論與結(jié)論

痛風(fēng)也稱尿酸鹽沉積癥，2017年以前學(xué)術(shù)界通常將該病的發(fā)生歸結(jié)為營(yíng)養(yǎng)因素[7]，如陳英輝[8]指出該病的發(fā)生主要是由于超量高鈣與高蛋白飼料的使用；周紅英[9]指出了同樣的飼料配比問題。自2017年以來，我國部分地區(qū)陸續(xù)從鵝痛風(fēng)典型癥狀的死亡鵝病料中分離到新型的鵝源星狀病毒[10]。遺傳進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)，該病毒與之前報(bào)道的所有禽類星狀病毒的基因型差異較大，臨床上該病可引起病鵝的關(guān)節(jié)腫大、生產(chǎn)性能下降、死淘率可達(dá)到30%～50%；解剖可見心包、腎臟和肝臟等內(nèi)臟表面有明顯的白色尿酸鹽附著，動(dòng)物回歸試驗(yàn)證明該病毒為痛風(fēng)癥狀的致病病原[11]。由于鵝星狀病毒為新型病毒，其與所有禽類星狀病毒的基因型差異較大，因此由該病原引起的鵝痛風(fēng)病目前尚無有效的商品化疫苗或抗體類生物制品能通過主動(dòng)或被動(dòng)免疫對(duì)其進(jìn)行有效防治。

卵黃抗體是指產(chǎn)蛋雞受特定抗原免疫后產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移和貯存在卵黃中的特異性抗體，從卵黃中將卵黃抗體提取并應(yīng)用在動(dòng)物疾病的防治中已得到廣泛認(rèn)可。目前，卵黃抗體的制備方法較多，但都存在工藝流程長(zhǎng)、步驟多、試劑消耗量大、需大型離心設(shè)備等缺點(diǎn)，給產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來一定困難的同時(shí)增加了卵黃抗體的制備成本[12]。

本研究用哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心前期分離鑒定的GAstV-DT株制備滅活疫苗，按不同免疫方案免疫蛋雞，在優(yōu)化了蛋雞免疫程序的基礎(chǔ)上比較了酸化水-辛酸法與其他3種方法制備卵黃抗體的優(yōu)勢(shì)。酸化水-辛酸法制備的卵黃抗體具有效價(jià)高、純度高、成本低、無需離心設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。盡管在制備中使用了化學(xué)試劑正辛酸，但辛酸在水中溶解度極低（0.062 g·L-1），在醫(yī)學(xué)工業(yè)中正辛酸已被廣泛應(yīng)用，對(duì)生物無不良作用[12]，且本工藝中3次濃縮復(fù)水極大地降低了卵黃抗體中辛酸的殘留量，提高了卵黃抗體的安全性。

抗體安全性和免疫效力是評(píng)價(jià)卵黃抗體使用效果的重要指標(biāo)[13]，本研究根據(jù)《獸用生物制品實(shí)驗(yàn)室安全和效力試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，對(duì)黃抗體進(jìn)了安全性和免疫效力評(píng)價(jià)。安全性試驗(yàn)結(jié)果顯示，卵黃抗體接種非靶動(dòng)物小鼠，小鼠全部健活，接種后無任何不良反應(yīng)；抗體以單倍劑量、單劑量重復(fù)和2倍超劑量接種1日齡健康易感雛鵝，雛鵝全部健活，接種部位抗體吸收良好，雛鵝增重指標(biāo)均與對(duì)照鵝無差異，表明該卵黃抗體安全性良好。

卵黃抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，卵黃抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)呈正相關(guān)，當(dāng)卵黃抗體效價(jià)在1∶128以上時(shí)，對(duì)雛鵝能起到有效的保護(hù)作用；抗體最小免疫劑量試驗(yàn)結(jié)果顯示，3日齡雛鵝最小免疫劑量為0.25 mL·只-1，4日齡和7日齡雛鵝最小免疫劑量為0.5 mL·只-1。但考慮到現(xiàn)地疫情復(fù)雜，雛鵝易受多種應(yīng)激因素影響，為保證卵黃抗體的免疫效果，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)中將接種劑量定為3日齡以下雛鵝0.25 mL·只-1；4日齡及以上雛鵝0.5 mL·只-1。由于卵黃抗體注射雛鵝產(chǎn)生的是被動(dòng)免疫保護(hù)，其有效保護(hù)產(chǎn)生的時(shí)間比刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生主動(dòng)免疫保護(hù)的時(shí)間更早，免疫持續(xù)期更短。在抗體產(chǎn)生和免疫持續(xù)期研究中，通過不同時(shí)間點(diǎn)的免疫攻毒試驗(yàn)得出，卵黃抗體的免疫保護(hù)產(chǎn)生期為卵黃抗體接種后8h，免疫持續(xù)期為5d。

綜上所述，本研究通過前期分離鑒定的GAs?tV-DT株制備了滅活疫苗并免疫產(chǎn)蛋雞，采集高免雞蛋，通過酸化水-辛酸法制備了卵黃抗體，該卵黃抗體安全、有效，適合工業(yè)化生產(chǎn)，可為我國防控鵝痛風(fēng)病提供有效的防治手段。