趙怡雯，蒼真?zhèn)ィ瑒?佳，胡永倩，李 巍，楊 卓，程淑晶，張玉平，于漢勛

（1.大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務中心，遼寧 大連 116000；2.大連市畜牧總站，遼寧 大連 116000；3.大連市金弘基種畜有限公司，遼寧 大連 116000）

奶牛副結核病是由副結核分枝桿菌引起的慢性消化道疾病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。奶牛副結核病以頑固性腹瀉、漸進性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺褶[1-2]為特征。由于該病潛伏期長（1～2年）、病程長，細菌培養(yǎng)困難，在臨床上很容易被誤診為其他細菌類腹瀉疾病，使病牛得不到及時有效的醫(yī)治，并且牛副結核分枝桿菌屬于細胞內(nèi)寄生菌，普通抗菌素不易進入細胞內(nèi)，一旦出現(xiàn)臨床癥狀則很難醫(yī)治。由于病牛的反復腹瀉常導致體重下降和產(chǎn)奶量降低，對奶牛場（戶）造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。為了解奶牛場的牛副結核發(fā)病狀況與凈化效果，大連市畜牧總站從2018年開始到2020年連續(xù)3年對大連地區(qū)規(guī)模奶牛場進行采樣檢測，共采集樣品3070份，對采集的樣品進行了血清學檢測?，F(xiàn)將檢測情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

從大連地區(qū)多家規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖企業(yè)（規(guī)模奶牛場存欄情況見表1）采集全血樣品，分離血清后于4℃冰箱中保存，備用。

表1 規(guī)模奶牛場存欄情況

1.2 試劑

牛副結核抗體檢測ELISA試劑盒（批號為8156），北京愛德士元亨生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器

酶標儀（型號為Multiskan MK3），美國Thermo?Multisk公司產(chǎn)品；96針全自動酶標洗板機（型號為PW-960Plus），深圳市匯松科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱（型號為SHP-250），上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 檢測步驟

1.4.1 樣品稀釋

按照檢測試劑盒的操作步驟，根據(jù)對照和待檢血清ELISA板布局，對檢測樣品用樣品稀釋液進行100倍稀釋，對陰陽對照進行20倍稀釋。用微量反應板振蕩器對反應板進行樣品混勻。封板后于24℃溫箱進行孵育1h。

1.4.2 預孵育樣品和抗原結合

取100μL預孵育樣品加入到已包被有抗原的微量反應板中，封板后于24℃溫箱孵育45min。

1.4.3 加酶標抗體

用洗板機對孵育完成的反應板進行洗板5次，于拍板紙上拍干后，加入100μL已進行20倍稀釋的酶標抗體。封板后于24℃溫箱孵育30min。

1.4.4 加底物

用洗板機對孵育完成的反應板進行洗板5次，于拍板紙上拍干后加入100μL底物液。在避光環(huán)境下24℃溫箱孵育10min。

1.4.5 加終止液

將孵育完成后的反應板加入100μL終止液，在酶標儀上進行讀數(shù)。

2 結果與分析

2.1 檢測結果

2018年共檢測8家規(guī)模奶牛場，每場按最低20%的存欄量抽檢，抽檢樣品總數(shù)為1767份，檢測結果陽性為142份，陽性率為8.04%。2019年共檢測10家規(guī)模奶牛場，每場抽檢樣品數(shù)為92份（其中一家抽檢樣品90份），抽檢樣品總數(shù)918份，檢測結果陽性為19份，陽性率為2.07%。2020年由于受新冠疫情影響，只對3家規(guī)模奶牛場要凈化轉(zhuǎn)場的犢牛進行全部檢測，檢測樣品總數(shù)為385份，檢測結果陽性為32份，陽性率為8.31%。具體檢測結果見表2。

表2 2018—2020年檢測數(shù)與檢測結果

2.2 結果分析

通過2018—2019年連續(xù)2年對規(guī)模奶牛場副結核抗體檢測結果進行對比，可知大連地區(qū)規(guī)模奶牛場副結核的整體陽性率由8.04 %下降至2.07 %，出現(xiàn)了明顯下降。同時，2年連續(xù)參與檢測的8家規(guī)?；膛龈苯Y核陽性率均呈下降趨勢,2019年奶牛副結核檢測陽性率明顯低于2018年。分析原因有兩點：一可能與當年副結核病的流行態(tài)勢有關；二可能與采取的檢測、隔離、消毒等凈化措施有關。

2020年檢測的3家規(guī)?；膛銎渲杏?家是連續(xù)3年都進行了檢測，另外1家是2019—2020年2年連續(xù)進行檢測，在2020年陽性率均出現(xiàn)了反彈現(xiàn)象。分析原因可能與當年檢測的樣品均為犢牛有關。

通過對表1和表2數(shù)據(jù)進行分析，結合養(yǎng)殖場飼養(yǎng)管理水平與生物安全控制措施，可以看出飼養(yǎng)管理水平高、生物安全措施管理到位，奶牛副結核的感染率相對較低，反之相對較高。因此，通過檢測、隔離、消毒等綜合防控措施是可以大大降低養(yǎng)殖場奶牛副結核的感染率，尤其是在目前沒有特效治療藥物和疫苗免疫時，通過采取檢測凈化手段及綜合防控措施是控制牛副結核病在場內(nèi)傳播行之有效的方法。

下一步應持續(xù)對大連市的規(guī)模奶牛場副結核感染情況進行檢測，并重點對2020年檢測的3家規(guī)模奶牛場及凈化轉(zhuǎn)場的犢牛群進行跟蹤監(jiān)測，條件允許時再開展副結核細菌的分離培養(yǎng)和分子生物學檢測，以摸清副結核病在奶牛場的感染規(guī)律，探索出大連市規(guī)模奶牛場副結核病凈化的綜合防控措施與標準。