陳霞，鄧晶，栗翠英，葉新華

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院 超聲診斷科，江蘇 南京211100；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 超聲醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京210029）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是一類具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移特征的異質(zhì)性惡性腫瘤，占所有乳腺癌類型的12%～20%[1]。TNBC 對內(nèi)分泌和靶向治療藥物不敏感，缺乏統(tǒng)一的治療方案，患者預(yù)后差、病死率高[2]。P53 是一種腫瘤抑制蛋白，通過促進細胞凋亡和DNA 修復(fù)調(diào)節(jié)細胞生長，P53突變可導(dǎo)致異常細胞增殖和腫瘤進展[3]。細胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6, CK5/6）是TNBC 的特征性腫瘤免疫組織化學(xué)標(biāo)志物之一，可作為判斷TNBC 預(yù)后的重要預(yù)測因子[4]。超聲檢查是乳腺癌篩查、術(shù)前診斷的常用影像學(xué)方法，超聲造影通過實時觀察造影劑在腫塊內(nèi)血流灌注過程，分析病灶病變情況，為腫塊性質(zhì)鑒別提供可靠影像數(shù)據(jù)支撐[5]。TNBC 超聲造影征象與P53、CK5/6 表達的關(guān)系尚不清楚，分析其關(guān)系有助于提高臨床診斷水平。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年7月—2020年6月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科行乳腺超聲造影的98 例TNBC 患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者接受手術(shù)治療，術(shù)后病理組織學(xué)診斷為TNBC，參考《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2015 版）》[6]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②女性患者，年齡≥18 周歲；③超聲造影圖像清晰，結(jié)果完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①Luminal 型、Her-2 型等其他類型乳腺癌；②合并其他部位惡性腫瘤；③男性患者。研究組患者年齡46～63 歲，平均（55.23±7.31）歲；腫塊直徑2～5 cm，平均（3.23±0.61）cm。另選取同期本院收治的103 例其他分子分型乳腺癌患者作為對照組，均確診為乳腺癌，免疫組織化學(xué)鑒別為Luminal 型、Her-2 陽性乳腺癌。對照組患者年齡42～65 歲，平均（55.61±7.07）歲；腫塊直徑2～6 cm，平均（3.29±0.75）cm。兩組年齡、腫塊直徑比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 乳腺超聲造影

患者均采用超聲診斷儀（意大利百勝集團）行乳腺超聲造影檢查，常規(guī)線陣探頭LA523 型，頻率4～13 MHz，造影線陣探頭LA522 型，頻率3～9 MHz?；颊哐雠P雙手抱頭暴露雙乳及腋下，涂耦合劑，以乳頭為中心行放射狀掃查，確定病灶位置、大小、形態(tài)、縱橫比、邊緣、內(nèi)部微鈣化、后方回聲、血流信號。血流信號采用Adler 半定量法[7]分級，0 級：無血流信號；Ⅰ級：1 或2 處點狀或細桿狀血流；Ⅱ級：長度大于病灶半徑的1 條血流或見幾條細小血流；Ⅲ級：2 條長度大于病灶半徑的血流或≥5 處點狀血流。選定病灶最大切面和血流最豐富切面，保持患者體位和探頭位置不變，經(jīng)肘靜脈通道團注六氟化硫微泡（聲諾維，上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司）懸液（59 mg 聲諾維+5 ml 生理鹽水）1.2 ml，推注生理鹽水5 ml 沖管。啟動增強圖像，觀察病灶內(nèi)造影劑走向和分布，直到增強程度減弱至接近造影前水平，儲存動態(tài)圖像。采用雙盲法由超聲科2 位主治醫(yī)師參考文獻[8]進行評估，內(nèi)容包括增強水平（高增強、等/低/無增強）、增強后結(jié)節(jié)范圍擴大情況、有無充盈缺損、有無均勻增強、有無穿支血管等。雙方不一致或不能確定的項目由主任醫(yī)師參與討論后確定結(jié)果。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測P53、CK5/6的表達

取兩組患者術(shù)中切除的TNBC 乳腺癌組織標(biāo)本各0.2 g，固定包埋后制成4 μm 切片，經(jīng)脫蠟，乙醇梯度水化，高壓，加入1%標(biāo)準(zhǔn)馬血清稀釋，4℃冰箱過夜，PBS 沖洗后加入P53、CK5/6 抗體。再經(jīng)蘇木精復(fù)染、乙醇梯度脫水干燥、二甲苯透明，中性樹膠封固后由病理科2 位主治醫(yī)師采用雙盲法進行審片。根據(jù)染色密度評分（無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分）和陽性細胞百分比評分（≤25%計1 分，>25%～50%計2 分，> 50%～75%計3 分，> 75%計4 分），計算免疫組織化學(xué)染色評分，免疫組織化學(xué)染色評分等于染色密度評分與陽性細胞百分比評分乘積，≥4 分為陽性，<4 分為陰性[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 兩組患者超聲征象比較

兩組患者腫塊形態(tài)、邊緣、微鈣化、后方回聲、血流分級比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），研究組腫塊形態(tài)規(guī)則、后方回聲增強、血流Ⅱ級和Ⅲ級比例患者多于對照組，邊緣模糊、有微鈣化比例患者少于對照組（P<0.05）。兩組腫塊直徑、縱橫比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1和圖1、2。

表1 兩組患者超聲征象比較 例（%）

圖1 研究組患者二維超聲征象

圖2 對照組患者二維超聲征象

2.2 兩組患者超聲造影征象比較

兩組患者增強程度、增強后結(jié)節(jié)范圍擴大、充盈缺損、均勻增強比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），研究組高增強、增強后結(jié)節(jié)范圍擴大不明顯、有充盈缺損患者多于對照組，有均勻增強患者少于對照組。兩組患者有無穿支血管比較，χ2檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2和圖3、4。

表2 兩組患者超聲造影征象指標(biāo)比較 例（%）

圖3 研究組患者超聲造影征象圖

圖4 對照組患者超聲造影征象圖

2.3 不同超聲征象TNBC患者的P53、CK5/6陽性率比較

TNBC患者P53陽性表達74例，陽性率為75.51%，CK5/6 陽性表達60 例，陽性率為61.22%。不同血流分級患者P53 陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），血流分級Ⅱ級、Ⅲ級患者的P53 陽性率高于血流分級0 級、I 級患者。邊緣清晰與邊緣模糊患者的CK5/6 陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），邊緣清晰患者的CK5/6 陽性率高于邊緣模糊患者。TNBC 患者其余各指標(biāo)的P53 陽性率、CK5/6 陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3 和圖5、6。

圖5 TNBC患者乳腺組織P53的表達

圖6 TNBC患者乳腺組織CK5/6的表達

2.4 不同超聲造影征象TNBC 患者的P53、CK5/6陽性率比較

不同增強程度患者的P53 陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），高增強患者的P53 陽性率低于等/低/無增強患者，增強后結(jié)節(jié)范圍擴大是否明顯患者的CK5/6 陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），增強后結(jié)節(jié)范圍擴大不明顯患者的CK5/6 陽性率高于增強后結(jié)節(jié)范圍擴大明顯患者。TNBC患者其余各指標(biāo)的P53陽性率、CK5/6陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

表3 不同超聲征象TNBC患者的P53、CK5/6陽性率比較 例（%）

表4 不同超聲造影征象TNBC患者的P53、CK5/6陽性率比較 例（%）

3 討論

乳腺癌是全世界發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤，不同類型乳腺癌臨床和分子生物學(xué)特征不同，治療反應(yīng)性、預(yù)后也不盡相同。與其他分子分型乳腺癌比較，TNBC 患者侵襲性更高，生存時間更短，40%的TNBC 患者于診斷后5年內(nèi)死亡[10-11]。因此早期識別和診斷TNBC 是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

超聲造影是一種純血池顯像技術(shù)，造影劑微泡直徑小，幾乎和血細胞相近，能隨血液循環(huán)分布到全身微小血管，微泡造影劑可增加靶組織和周圍組織的聲阻抗差異提高圖像分辨率，實時動態(tài)顯示靶組織的血流灌注特點，在乳腺癌的診斷、療效評估、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判定中有較高價值[12]。本研究發(fā)現(xiàn)TNBC 超聲征象與其他分子分型乳腺癌存在一定差異性，表現(xiàn)為TNBC 多形態(tài)規(guī)則，邊緣清晰，后方回聲增強，血流分級較高，同時內(nèi)部微鈣化少見。張慧等[13]、馬文娟等[14]同樣也發(fā)現(xiàn)TNBC 腫塊形態(tài)更規(guī)則，邊界毛刺更少。TNBC 后方回聲增強原因與內(nèi)部成分有關(guān)，當(dāng)腫塊成纖維細胞含量增加時，對超聲波吸收能力增強，導(dǎo)致腫塊后方衰減，反之則增強[15-16]。超聲造影征象比較，TNBC 超聲增強后結(jié)節(jié)范圍擴大不明顯，造影劑在結(jié)節(jié)內(nèi)分布不均勻，內(nèi)部存在充盈缺損。其他分子分型乳腺癌超聲增強后結(jié)節(jié)內(nèi)部分布尚均勻，內(nèi)部充盈缺損較少，增強后結(jié)節(jié)范圍擴大明顯。其原因為高微血管密度可能導(dǎo)致增強后結(jié)節(jié)內(nèi)回聲不均勻[17]，出現(xiàn)充盈缺損的原因為惡性程度高的腫瘤新生血管多分布于腫瘤邊緣，由于腫瘤細胞生長過快，導(dǎo)致新生血管難以滿足腫瘤細胞需求，發(fā)生局部缺血壞死[18]，造影時出現(xiàn)充盈缺損。張雪松等[19]指出充盈缺損與雌激素受體陰性表達有關(guān)，但尚不支持充盈缺損可作為TNBC 的診斷依據(jù)。增強后結(jié)節(jié)范圍擴大不明顯可能與癌灶內(nèi)含大量結(jié)締組織和纖維組織，質(zhì)地硬，影響新生血管生成有關(guān)[20]。

為更好地了解超聲造影特征的意義，提高診斷效率，有必要關(guān)注超聲造影征象與乳腺癌分子標(biāo)志物的關(guān)系。P53 被稱為抑癌蛋白，具有調(diào)控細胞周期、DNA 復(fù)制作用，P53 突變或聚集時會失去原有功能，導(dǎo)致腫瘤進展和生長。P53 在TNBC 中表達上調(diào)，且與腫瘤分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)[21]。本研究結(jié)果表明，P53 表達與TNBC 腫塊結(jié)節(jié)血流信號分級、高增強有關(guān)，分析原因為P53陽性表達可促使腫瘤細胞增殖和新生血管生成[22]，在超聲影像學(xué)表現(xiàn)為病灶血供豐富，造影時出現(xiàn)高增強。CK5/6 是腫瘤免疫組織化學(xué)標(biāo)志物，在尿路上皮腫瘤[23]、TNBC[24]、肺鱗癌[25]等多種惡性腫瘤中呈陽性表達，CK5/6 陽性表達與TNBC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ki-67 表達有關(guān)[24]。本研究中CK5/6 陽性表達率為61.22%，CK5/6 陽性表達與邊界清晰，增強后結(jié)節(jié)范圍擴大不明顯有關(guān)，楊潔等[26]也指出CK5/6陽性表達的TNBC 結(jié)節(jié)邊界多清晰，內(nèi)部回聲多不均勻。CK5/6 陽性表達者增強后結(jié)節(jié)范圍擴大不明顯的原因可能為：CK5/6 的陽性表達代表腫瘤增殖力越強，因此病灶密度偏大，進而影響造影劑在血管內(nèi)充盈。以上結(jié)果說明P53、CK5/6 表達與TNBC 超聲造影表現(xiàn)具有一定關(guān)系，與P53、CK5/6相關(guān)的影像征象可為臨床診療提供依據(jù)。

綜上所述，TNBC 與其他分子分型乳腺癌患者超聲二維和造影征象均存在明顯差異，TNBC 外觀缺乏惡性征象，但血流分級偏高，造影后呈高增強，增強后結(jié)節(jié)范圍擴大不明顯，且可出現(xiàn)充盈缺損。P53 陽性表達者血流信號分級偏高，造影后高增強，而CK5/6 陽性表達者腫塊邊界清晰，增強后結(jié)節(jié)范圍擴大不明顯。與P53、CK5/6 表達相關(guān)超聲造影征象有望作為鑒別TNBC 的參考指標(biāo)。