萬毅，謝明月，唐云，張麗嬌

（攀枝花市婦幼保健院 保健部，四川 攀枝花617000）

母嬰垂直傳播不僅是HBV 攜帶者感染的主要途徑，也是肝硬化、肝細(xì)胞肝癌發(fā)生的高危因素[1-3]?，F(xiàn)階段臨床尚未完全明確新生兒乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）宮內(nèi)感染的發(fā)生機(jī)制，有研究認(rèn)為，細(xì)胞免疫因子失衡可能是HBV 宮內(nèi)感染的主要發(fā)生機(jī)制[4]。另外，彈性蛋白酶特異性抑制物（Elafin）是妊娠期固有免疫防御系統(tǒng)的重要成分之一，在提高母胎抗感染防御能力方面具有一定促進(jìn)作用，但其對(duì)胎兒宮內(nèi)感染保護(hù)作用研究較少?；诖?，本研究通過測(cè)定新生兒臍血細(xì)胞因子濃度，探討Elafin、白細(xì)胞介素18（IL-18）、γ-干擾素（IFN-γ）/白細(xì)胞介素4（IL-4）與HBV 宮內(nèi)感染的關(guān)系，闡明HBV 宮內(nèi)垂直傳播過程中免疫缺陷機(jī)制，為進(jìn)一步抑制HBV 宮內(nèi)傳播研究提供免疫學(xué)理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2019年5月攀枝花市婦幼保健院收治的HBV 攜帶產(chǎn)婦分娩的新生兒96 例。其中，男性48 例，女性48 例；產(chǎn)婦年齡23～35 歲，平均（29.39±2.72）歲；胎齡36～41 周，平均（38.21±1.04）周；自然分娩45 例，剖宮產(chǎn)51 例。根據(jù)HBV宮內(nèi)感染情況分為宮內(nèi)感染組和宮內(nèi)未感染組，分別為31 和65 例。另選取同期非HBV 攜帶且健康產(chǎn)婦分娩的新生兒90 例作為對(duì)照組，其中男性44 例，女性46 例；產(chǎn)婦年齡22～36 歲，平均（28.89±3.15）歲；胎齡35～42 周，平均（37.98±1.23）周；自然分娩42 例，剖宮產(chǎn)48 例。宮內(nèi)感染組、宮內(nèi)未感染組新生兒出生時(shí)，臍血HBV-DNA> 1.00×103copies/ml；對(duì)照組新生兒出生時(shí)，肝功能正常，且Apgar 評(píng)分均為8～10 分。3 組臨床資料完整，且監(jiān)護(hù)人均知情并簽署同意書。排除存在妊娠期前兆流產(chǎn)史、先兆早產(chǎn)史、陰道炎、胎兒宮內(nèi)窘迫或先天畸形、配偶攜帶HBV、妊娠期合并糖尿病、高血壓者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 Elafin水平檢測(cè)收集6 ml 臍帶靜脈血，以3 000 r/min 離心5 min，分離取上清液，置于80℃冷庫(kù)保存，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。用重蒸水1∶20 稀釋，使用前加入蒸餾水混勻，配置成溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管，第1 管加入標(biāo)本稀釋液，第2～8 管加入標(biāo)本稀釋液。在第1 管中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液混勻后，吸出移至第2管，反復(fù)操作，對(duì)倍稀釋，后于第7管中吸出棄去。第8 管為空白對(duì)照。10×標(biāo)本稀釋液以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline, PBS）作稀釋。取20 μl 待測(cè)Elafin，加入180 μl 稀釋液，稀釋10 倍。每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，將反應(yīng)板充分混勻后稀釋，并在37℃室溫下放置2 h；洗板；每孔加入一抗，充分混勻反應(yīng)板后37℃室溫下放置60 min；洗板；每孔加100 μl 酶標(biāo)抗體工作液，充分混勻反應(yīng)板后37℃室溫下放置30 min；洗板；每孔加100μl底物工作液，37℃室溫下暗處反應(yīng)15 min；每孔加100μl室溫下終止液混勻，30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度，波長(zhǎng)為450 nm。在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，得出直線回歸方程，將樣品吸光度代入方程，得出樣品濃度。

1.2.2 IL-18、IFN-γ、IL-4 水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司。在96 孔酶標(biāo)包被板上設(shè)6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的質(zhì)量濃度由高到低依次為25 pg/ml、50 pg/ml、100 pg/ml、200 pg/ml、400 pg/ml 及800 pg/ml，每孔加50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品。設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。待測(cè)樣品孔中先加50 μl 樣品。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕晃混勻；封板，置37℃恒溫箱溫育1 h；蒸餾水與濃縮洗滌液以1∶20 稀釋后備用；揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 min 后棄去，反復(fù)3～5 次，拍干；每孔加50 μl 顯色劑A、50 μl 顯色劑B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；每孔加50 μl 終止液，終止反應(yīng)；空白孔調(diào)零，30 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光度，波長(zhǎng)為450 nm。在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，得出直線回歸方程，將樣品吸光度代入方程，得出樣品濃度。

1.2.3 新生兒宮內(nèi)感染者HBV-DNA 載量檢測(cè)新生兒出生24 h 內(nèi)，在接種乙型肝炎疫苗前，抽取5 ml 外周血，以熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)HBVDNA 載量，試劑盒購(gòu)自上海撫生實(shí)業(yè)有限公司。取出HBV 反應(yīng)混合液，室溫下融化、振蕩混勻，以2 000 r/min 離心10 min。取19.4 μl HBV 反應(yīng)混合液和0.6 μl Taq 酶加入離心管，混勻，以20 μl 量分裝至PCR 薄壁管中。按順序?qū)?0 μl 的陰性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照、強(qiáng)陽性對(duì)照、定量標(biāo)準(zhǔn)品、樣品洗脫液加入至反應(yīng)液中，蓋緊反應(yīng)管。將各反應(yīng)管按順序放入熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性5 min，先做45 個(gè)循環(huán)，最后按60℃變性30 min 再做45 個(gè)循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)

比較3 組Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFNγ/IL-4 水平。分析新生兒HBV 宮內(nèi)感染者與未感染者臨床特征。比較不同HBV-DNA 載量宮內(nèi)感染者臍血因子水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。采用多因素Logistic 回歸分析新生兒HBV 宮內(nèi)感染的影響因素。相關(guān)性分析采用Pearson 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比較

3 組Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），宮內(nèi)感染組Elafin、IL-18、IFN-γ、IFN-γ/IL-4 水平低于宮內(nèi)未感染組、對(duì)照組，IL-4 水平高于宮內(nèi)未感染組、對(duì)照組（P<0.05）。見表1。

表1 3組Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比較 （±s）

表1 3組Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4水平比較 （±s）

組別宮內(nèi)感染組宮內(nèi)未感染組對(duì)照組F 值P 值n 31 65 90 Elafin/（ng/ml）2.61±0.57 5.48±1.26 9.39±2.43 180.962 0.000 IL-18/（ng/L）32.50±7.46 126.31±28.07 153.02±32.35 211.462 0.000 IFN-γ/（ng/L）410.08±47.41 525.13±36.49 511.57±66.25 51.147 0.000 IL-4/（ng/L）628.62±70.34 571.39±62.58 560.84±65.33 12.674 0.000 IFN-γ/IL-4 0.65±0.12 0.92±0.18 0.91±0.20 27.257 0.000

2.2 宮內(nèi)感染組與宮內(nèi)未感染者組臨床特征比較

宮內(nèi)感染組與宮內(nèi)未感染者組的胎齡、性別、分娩方式、胎位、產(chǎn)婦年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。宮內(nèi)感染組與宮內(nèi)未感染者組產(chǎn)婦HBV 大三陽、產(chǎn)婦羊水情況、產(chǎn)婦陰道流血史的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 宮內(nèi)感染組與宮內(nèi)未感染者組臨床特征比較

2.3 新生兒HBV 宮內(nèi)感染的多因素Logistic 回歸分析

以新生兒HBV 宮內(nèi)感染作為因變量，以產(chǎn)婦HBV 大三陽、產(chǎn)婦羊水渾濁、產(chǎn)婦陰道流血史、Elafin、IL-18、IFN-γ、IL-4 及IFN-γ/IL-4 作為自變量，進(jìn)行一般多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，產(chǎn)婦HBV 大三陽、產(chǎn)婦羊水渾濁、產(chǎn)婦陰道流血史、Elafin、IL-18 及IFN-γ/IL-4 是新生兒HBV宮內(nèi)感染的影響因素（P<0.05）。見表3。

表3 新生兒HBV宮內(nèi)感染的多因素Logistic回歸分析參數(shù)

2.4 相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Elafin 與IL-18呈正相關(guān)（r=0.649，P=0.000）， IFN- γ/IL-4 與Elafin、IL-18呈正相關(guān)（r=0.529 和0.499，均P=0.000）。見圖1～3。

圖1 IL-18與IFN-γ/IL-4的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.5 不同HBV-DNA 載量宮內(nèi)感染者臍血因子水平比較

HBV-DNA 載量≥1.00×104copies/ml 與< 1.00×104copies/ml 患者分別有13 例和18 例。兩組Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），≥104copies/ml 患者較< 104copies/ml患者低。見表4。

圖2 Elafin與IFN-γ/IL-4的相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖3 IL-18與Elafin的相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.6 臍血因子與HBV-DNA載量相關(guān)性

HBV-DNA 載量< 1.00×104copies/ml 賦值為1，≥1.00×104copies/ml 賦值為2。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4與HBV-DNA載量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.601、-0.556和-0.712，均P=0.000）。見圖4～6。

表4 不同HBV-DNA載量宮內(nèi)感染者臍血因子水平比較（±s）

表4 不同HBV-DNA載量宮內(nèi)感染者臍血因子水平比較（±s）

HBV-DNA載量≥1.00×104copies/ml<1.00×104copies/ml t 值P 值n 13 18 Elafin/（ng/ml）2.11±0.53 2.97±0.61 4.086 0.000 IL-18/（ng/L）28.84±5.29 35.14±6.55 2.856 0.008 IFN-γ/IL-4 0.54±0.10 0.73±0.15 3.966 0.000

圖4 Elafin與HBV-DNA載量的相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖5 IL-18與HBV-DNA載量的相關(guān)性散點(diǎn)圖

圖6 IFN-γ/IL-4與HBV-DNA載量的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

有研究認(rèn)為，激活炎癥因子與其所分泌的細(xì)胞因子在宮內(nèi)抗感染免疫中起關(guān)鍵作用[5-7]。目前普遍認(rèn)為IFN-γ/IL-4 細(xì)胞因子失衡是HBV 感染慢性化的主要因素，嚴(yán)重影響細(xì)胞免疫、體液免疫[8-9]。本研究結(jié)果顯示，IFN-γ、IFN-γ/IL-4 在新生兒HBV 宮內(nèi)感染者出現(xiàn)降低趨勢(shì)，相反，IL-4則出現(xiàn)升高態(tài)勢(shì)。思希堯[10]研究也證實(shí)HBV 宮內(nèi)感染存在Th1/Th2 細(xì)胞失衡。進(jìn)一步多因素Logistic回歸分析可知，Elafin、IFN-γ/IL-4 是新生兒HBV宮內(nèi)感染的保護(hù)因素。推測(cè)Th1/Th2 免疫平衡失調(diào)可能參與新生兒HBV 宮內(nèi)感染發(fā)生。

IL-18 多由巨噬細(xì)胞分泌，可促使外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生高水平的INF-γ，調(diào)節(jié)Thl/Th2 平衡[11]。另外經(jīng)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-18 能誘導(dǎo)特異性Thl細(xì)胞應(yīng)答，強(qiáng)化NK 細(xì)胞毒性作用，選擇性促進(jìn)IL-2、IFN-γ 合成，激發(fā)Thl 應(yīng)答，提高機(jī)體病毒清除能力[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)感染組IL-18 水平明顯低于宮內(nèi)未感染組。任常軍等[13]觀點(diǎn)認(rèn)為，IL-18 水平偏低導(dǎo)致機(jī)體T 細(xì)胞免疫難以被有效激活，致使INF-γ 生成含量銳減，IL-4 分泌增多，引發(fā)Thl/Th2 細(xì)胞免疫失衡，故筆者推測(cè)IL-18 與宮內(nèi)感染有密切聯(lián)系。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)IL-18 與IFN-γ/IL-4 呈正相關(guān)，說明IL-18 能強(qiáng)化Thl 介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，有望成為HBV 宮內(nèi)感染免疫治療新靶位。因此，早期檢測(cè)IL-8 水平對(duì)初步篩查HBV 宮內(nèi)感染、及時(shí)應(yīng)用免疫干預(yù)具有指導(dǎo)意義。

近年來，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)除胎盤屏障外，胎盤、胎膜及羊水中還存在Elafin 等天然抗微生物物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)胎兒正常發(fā)育具有重要作用[14]。同時(shí)，國(guó)外報(bào)道還發(fā)現(xiàn)，Elafin 富含抗蛋白酶、抗感染活性，可能參與控制妊娠期過渡的炎癥反應(yīng)與組織損傷[15]。王慧華[16]通過檢測(cè)新生兒Elafin 發(fā)現(xiàn)，Elafin在HBV 宮內(nèi)感染患兒中呈異常低表達(dá)狀態(tài)，支持本研究觀點(diǎn)。Elafin 表達(dá)異常可增強(qiáng)蛋白酶活性，影響抗菌肽分泌，致使胎膜早破，影響天然免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，Elafin 是新生兒HBV 宮內(nèi)感染的保護(hù)因素，并與IL-18 呈正相關(guān)。推測(cè)Elafin 水平升高能降低Th 細(xì)胞對(duì)HBsAg 免疫耐受。進(jìn)一步經(jīng)Pearson 分析發(fā)現(xiàn)，Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4 與HBV-DNA 載量呈負(fù)相關(guān)。因此綜合檢測(cè)Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4，可為臨床評(píng)估HBV宮內(nèi)感染程度提供數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，Elafin、IL-18、IFN-γ/IL-4 在新生兒宮內(nèi)感染中呈異常表達(dá)，并與HBV-DNA 載量密切相關(guān)。