聶志娟，邵乃磷，張志偉，胡佳雯，徐 跑，徐鋼春

（1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室，江蘇無錫214081；2江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇省海水魚類遺傳育種重點實驗室，江蘇南通226007；3南京農(nóng)業(yè)大學(xué)漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214081）

0 引言

黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)，隸屬鱸形目(Perciformes)，鯛科(Sparidae)棘鯛屬(Acanthopagrus)，為暖溫性底層魚類，廣泛分布于中國東南、朝鮮半島南部、日本及東南亞等地附近海域，因其具有生長快、抗病力強、廣鹽性、廣溫性、營養(yǎng)豐富等多種生物學(xué)優(yōu)良特性，已成為了中國海水集約化養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類品種[1-2]，并形成了網(wǎng)箱養(yǎng)殖、傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖、池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖等多種黑鯛養(yǎng)殖模式[3]。其中池塘流水槽循環(huán)水養(yǎng)殖，是中國漁業(yè)轉(zhuǎn)型升級、創(chuàng)新發(fā)展的一種健康生態(tài)養(yǎng)殖新模式，具有節(jié)水節(jié)地、高產(chǎn)量、低漁藥使用量、污物資源化利用、養(yǎng)殖全程可控等優(yōu)點[4]。

不同養(yǎng)殖水體中，都棲息生存著大量的微生物群體，其種類繁多、功能復(fù)雜、遺傳代謝方式多樣，在營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和外源物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化中起著非常重要的作用，調(diào)節(jié)物質(zhì)元素循環(huán)過程的平衡并維持生態(tài)系統(tǒng)的健康[5-6]。生活在水體中養(yǎng)殖動物，其腸道作為食物消化吸收重要器官，同樣吸附寄生豐富的微生物，形成特有的腸道微生態(tài)系統(tǒng)，參與宿主魚生長免疫等代謝調(diào)控[7-8]。腸道微生物菌群組成受到許多內(nèi)源性和外源性因素的影響，如物種、生活方式、喂養(yǎng)習(xí)慣、飲食、營養(yǎng)狀況、生活條件等[9-10]。在外源性環(huán)境因素中，生長水體與微生物緊密相關(guān)，在很大程度上影響魚類腸道細菌群落的結(jié)構(gòu)和豐度[11]。不同養(yǎng)殖模式造就不同的生長環(huán)境，其群落組成結(jié)構(gòu)存在明顯差異[12-13]，對養(yǎng)殖動物具有很大影響。眾多研究表明，養(yǎng)殖模式能影響?zhàn)B殖水質(zhì)[14]、魚類的生長性能[15]、肌肉品質(zhì)[16]、免疫性能[17]等，然而水產(chǎn)養(yǎng)殖中水質(zhì)調(diào)節(jié)，魚類生長、免疫、消化、吸收等都與環(huán)境中的微生物息息相關(guān)[18-19]，因此，深入了解水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)信息對整個水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的生態(tài)綠色健康發(fā)展有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的微生物種群結(jié)構(gòu)研究建立在菌群分離和培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上，但因整個生態(tài)系統(tǒng)中99%的微生物是不可培養(yǎng)，此方法因費時費力，培養(yǎng)菌群有限而發(fā)展受限[20]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)的進步，變性梯度凝膠電泳[21]、擴增子[22]和宏基因組[23]測序被相聚用于表征和分析各種環(huán)境下的微生物群落，獲取微生物的分類圖譜，進行菌群多樣性和菌群功能預(yù)測分析。本研究利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)，將首次在黑鯛傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖和池塘流水槽循環(huán)水養(yǎng)殖兩種養(yǎng)殖模式下，從養(yǎng)殖水體、黑鯛腸道細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的角度，探究2種養(yǎng)殖模式對黑鯛腸道及養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)以及組成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗魚來源

養(yǎng)殖實驗在江蘇省南通市通州灣漁業(yè)發(fā)展有限公司進行。實驗所用黑鯛苗種由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所海水增養(yǎng)殖技術(shù)及種苗中心自主培育，分別在池塘循環(huán)水流水槽（磚混結(jié)構(gòu)）和傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘2種養(yǎng)殖模式條件下飼喂60天。每種養(yǎng)殖模式3個平行組。流水槽由氣提推水增氧區(qū)、養(yǎng)殖區(qū)（長20 m×寬5 m×水深2 m）、集排污區(qū)(30 m×5 m)和水質(zhì)凈化區(qū)(5.33 hm2)；傳統(tǒng)池塘面積為0.13 hm2，水深2.5 m。海水水質(zhì)清新、無污染，符合《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2 樣品采集與處理

養(yǎng)殖60天后，進行實驗采樣，采樣前試驗魚饑餓24 h。每個試驗平行組隨機取4尾魚，保證每個模式取12尾魚。采用MS-222（200 mg/L）將其麻醉，先用75%的乙醇擦拭體表，在無菌環(huán)境下立即解剖采集腸道，無菌解剖刀刮取腸道內(nèi)容物，每個平行組2尾魚的腸道內(nèi)容物合并為1個樣品，冷凍保存，后續(xù)用于總DNA提取。在養(yǎng)殖水體均勻分散10處點各采集3 L水樣，混勻，用0.22 μm濾膜抽濾收集，分裝6份，冷凍保存。

1.3 樣本總DNA提取、PCR擴增及測序

根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對 V3-V4 可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序為：95℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min（PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型）。擴增體系為20 μL，4 μL 5*FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引 物 (5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST(Promega,USA)進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(Illumina,SanDiego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫。構(gòu)建文庫步驟：（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接：（1）設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；（2）根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，拼接時overlap之間的最大錯配率為0.2，長度需大于10 bp。（3）根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物將序列拆分至每個樣本，barcode需精確匹配，去除存在模糊堿基的序列。使用的UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設(shè)置比對閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于16S rRNA測序的菌群多樣性特征

4組24個樣品所測得的原始數(shù)據(jù)共1315602條，通過對測序所得的序列進行預(yù)處理，過濾低質(zhì)量、長度短和模糊序列后，獲得用于后續(xù)分析的有效合格16Sr DNA序列1086274條，每個樣本產(chǎn)生的有效序列數(shù)目在33013～ 70087之間，有效序列的平均長度為432 bp，序列覆蓋度＞99.7%，表明測序真實反映各樣品的微生物組成。對所有序列進行97%相似水平OTU劃分并物種注釋，可劃分為1730個OTU，分類為34個門、72個綱、168個目、324個科、719個屬、1091個種。

黑鯛腸道和養(yǎng)殖水體中細菌群落的物種豐富度和多樣性結(jié)果如圖1所示。Sobs和Ace指數(shù)均表明，2種養(yǎng)殖模式條件下，黑鯛腸道菌群豐富度極顯著高于其對應(yīng)的養(yǎng)殖水體(P≤0.01)；IP模式水體菌群豐富度顯著高于EP模式水體(P≤0.01)；IP模式腸道菌群豐富度與EP模式腸道差異不顯著(P>0.05)。Simpson指數(shù)顯示，EP和IP兩種模式養(yǎng)殖黑鯛腸道菌群多樣性無顯著性差異(P>0.05)；EP模式水體菌群多樣性高于IP模式水體(P≤0.05)，而Pd指數(shù)顯示相反的結(jié)果(P≤0.05)。Pd指數(shù)為譜系多樣性指數(shù)，它同時考慮物種豐度以及進化距離。Pd指數(shù)顯示，EP和IP兩種模式黑鯛腸道菌群多樣性均極顯著高于其對應(yīng)的養(yǎng)殖水體(0.0010.05)。

圖1 兩種模式下4組樣品中細菌豐富性和多樣性

利用主坐標(biāo)分析(PCoA)反映兩種模式下菌群群落的β多樣性，主成分1(PC1)貢獻率36.68%，主成分2(PC2)的貢獻率為18.86%（圖2A），不同組的腸道、養(yǎng)殖水體菌群明顯分開，且組內(nèi)重復(fù)樣品菌群群落聚集在一起，這表明樣品具有很好的重復(fù)性，組間具有明顯的微生物群落差異，種間差異明顯大于種類差異(P≤0.01)。樣品菌群層次聚類分析結(jié)果與PCoA類似，4組樣品分別聚為一簇，而其中兩種模式養(yǎng)殖水體樣品菌群結(jié)構(gòu)距離更近（圖2B）。

圖2 兩種模式下所有樣品微生物群落PCoA排序圖(A)和層級聚類分析(B)

2.2 兩種模式下菌群結(jié)構(gòu)組成

由圖3可以看出，在門水平上，兩種養(yǎng)殖模式下菌群結(jié)構(gòu)組成種類比較相似，優(yōu)勢菌群主要由變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻細菌(Cyanobacteria)、厚壁菌門 (Firmicutes)、擬 桿 菌 門(Bacteroidetes)和綠彎菌門(Chloroflexi)組成，其豐度之和為98.32%～ 99.22%。為了減少群落的復(fù)雜性和冗余性，相對豐度低于1%的群落都歸為稀有種，并為“others”[24]。

圖3 兩種模式下4組樣品菌群組成（A：門水平，B：屬水平）

由圖4可以看出，在屬水平上，EP模式腸道菌群豐度大于1%的菌屬有17個，優(yōu)勢菌屬主要包括發(fā)光桿菌屬 Photobacterium(11.30%)，腸桿菌屬Enterobacter(10.31%)，分枝桿菌屬Mycobacterium(10.30%)，Romboutsia(7.37%)，腸球菌屬 Enterococcus(6.29%)，乳球菌屬Lactococcus(5.38%)；IP模式腸道菌群豐度大于1%的菌屬有15個，優(yōu)勢菌屬主要包括魯杰氏菌屬Ruegeria(14.84%)，聚球藻屬Synechococcus(14.24%)，發(fā)光桿菌屬 Photobacterium(11.97%)，未分類梭狀芽孢桿菌屬unclassified_f_clostridiaceae(7.96%)；EP模式水樣菌群豐度大于1%的菌屬有14個，優(yōu)勢菌屬主要為：聚球藻屬(28.41%)，norank_o_PeM15(14.71%)，分 枝 桿 菌 屬 (14.60%)，norank_f_Saprospiraceae(10.86%)；IP模式水樣菌群豐度大于1%的菌屬有13個，優(yōu)勢菌屬主要為：聚球藻屬(46.19%)，norank_o_PeM15(9.71%)，Marivita(5.99%)。

2.3 兩種模式下差異菌屬分析

運用Wilcoxon秩和檢驗檢測不同組中菌群群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種。對所有4組樣品進行屬水平差異分析，并顯示豐度在前20的菌屬，圖4中可看出，18個具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(0.01≤P≤0.05)，占90%；3個具有極顯著差異(0.001≤P≤0.01)，占15%；14個具有極顯著差異(P≤0.001)，占70%。具有顯著差異的主要菌屬為聚球藻屬、norank_o__PeM15、分枝桿菌屬、魯杰氏菌屬、norank_f__Saprospiraceae、Marivita、腸桿菌屬、unclassified_f__Clostridiaceae_1、Romboutsia、norank_f__Microbacteriaceae、腸球菌屬、Candidatus_Aquiluna、乳 球 菌 屬 、norank_f__Rho dobacteraceae、norank_f__Acidimicrobi aceae、norank_f__TM146、Candidatus_Arthromitus。分別對相似生境的組樣品進行兩兩比較分析，在不同模式下的黑鯛腸道樣品中，排名前15的豐富菌屬中有10個菌屬有顯著性差異（P≤0.05），占66.67%，其中聚球藻屬、Ruegeria、norank_o__PeM15、Marivita、norank_C__K D4-96(IP＞EP)，分枝桿菌屬、腸桿菌屬、Romboutsia、腸球菌、乳球菌屬IP＜EP)。在不同模式下的養(yǎng)殖水體樣品中，排名前15的豐富菌屬中有13個菌屬有顯著性差異(P≤0.05)，占86.67%，其中聚球藻屬、Marivita、unclassified_f__Rhodobacteraceae、norank_f__Rhodob acteraceae、norank_f__FamilyI、norank_f__TM146(IP＞EP)，norank_o__PeM15、分支桿菌屬 、norank_f__Saprospiraceae、norank_f__Microbacteriac eae、Candidatus_Aquiluna、CL500-29_marine_group、紅菌屬Rhodobium(IP＜EP)。

圖4 兩種模式下菌屬差異分析

3 討論與結(jié)論

本研究中，高通量測序獲得1086274條有效序列，序列覆蓋度超過99.7%，結(jié)合Sobs、Ace、Simpson、Pd指數(shù)顯示黑鯛腸道和養(yǎng)殖水體中細菌群落非常豐富和多樣，這與眾多研究結(jié)果顯示一致[25-27]，驗證了高通量測序在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的絕對優(yōu)勢[28]。不同養(yǎng)殖模式黑鯛腸道和其相應(yīng)的養(yǎng)殖水體之間，與不同的養(yǎng)殖模式水體之間的微生物豐富度和多樣性存在顯著差異，說明不同養(yǎng)殖模式形成的不同養(yǎng)殖環(huán)境具有不同的微生物菌群結(jié)構(gòu)；而不同養(yǎng)殖模式黑鯛腸道之間無顯著差異，因為試驗黑鯛來自同一批繁育魚苗，腸道對于菌群是特殊的寄生環(huán)境，相同的宿主腸道對菌群具有一定的宿主選擇性。分析微生物多樣性研究中，較多的研究者選擇Simpson和Shannon指數(shù)[29-30]，而采用Pd指數(shù)相對較少，在本研究中，Simpson指數(shù)顯示EP模式水體菌群多樣性高于IP模式水體，而Pd指數(shù)顯示結(jié)果恰好相反。張志敏[31]對南方鲇孵化后8dpf、35dpf和125dpf的腸道、攝食食物和生長水樣微生物多樣性比較分析，得出3個不同階段，除了Pd指數(shù)外，水體中的多樣性指數(shù)普遍高于攝食食物。因此，在進行多樣性分析時盡量選擇兩種以上的分析方法，多角度評價闡述。

和很多動物一樣，生存環(huán)境對水生動物的具有特定的選擇性壓力，最終逐漸促使其對環(huán)境的適應(yīng)。不同環(huán)境具有不同的環(huán)境因子脅迫，所形成的微生態(tài)也是有差異的，同時環(huán)境微生態(tài)對魚類具有免疫壓力[31]，大量的研究從水質(zhì)調(diào)控、生態(tài)進化及宿主的環(huán)境影響角度探究魚類微生物群落組成特征[32-34]。而對于不同養(yǎng)殖模式菌群結(jié)構(gòu)研究較少。李存玉等[35]對工廠化和池塘養(yǎng)殖牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)差異性和系統(tǒng)進化分析表明，兩種養(yǎng)殖條件下牙鲆腸道菌群結(jié)構(gòu)與餌料中菌群關(guān)系密切，此外受養(yǎng)殖水環(huán)境中菌群影響較大。池塘養(yǎng)殖和海上吊籠養(yǎng)殖仿刺參腸道菌群的結(jié)構(gòu)存在較大差異，且在池塘養(yǎng)殖仿刺參腸道內(nèi)茅孢桿菌等益生菌的占比較高，海上吊籠養(yǎng)殖仿刺參分離得到較多的弧菌屬細菌[36]。本文在池塘循環(huán)水流水和傳統(tǒng)池塘黑鯛養(yǎng)殖兩種模式下開展菌群結(jié)構(gòu)研究，其組成在門水平種類比較相似，優(yōu)勢菌群主要由變形菌門、放線菌門、藍藻細菌、厚壁菌門、擬桿菌門和綠彎菌門組成，這與許多報道一致[37-39]。此外，在所有樣品菌屬差異分析得出豐度前20的菌屬中90%具有顯著差異，結(jié)合層次聚類、主成分分析表明四組樣品明顯分開聚類，說明養(yǎng)殖模式可以影響微生物群落組成結(jié)構(gòu)[40]。

兩種模式黑鯛腸道樣品中，前15的豐富菌屬中有10類的菌屬有顯著性差異，占66.67%，其中，聚球藻、魯杰氏菌和Marivita菌屬是循環(huán)水池塘養(yǎng)殖模式下黑鯛腸道中豐富顯著優(yōu)勢可鑒定菌屬群。聚球藻是海洋光合自養(yǎng)原核生物的優(yōu)勢代表類群，是全球碳循環(huán)的主要參與者和初級生產(chǎn)力的主要貢獻者，在海洋微食物網(wǎng)中生物量循環(huán)迅速，能量轉(zhuǎn)換效率高[41]。陳竺等[42]研究得出聚球藍細菌可作為飼料添加劑，能夠提高免疫相關(guān)酶的活性，增強幼蝦對白斑綜合征病毒感染的防御能力。Miura等[43]從水族館保存的一個健康魚群中成功分離到3株Ruegeria sp.菌株，抑制了珊瑚弧菌P1的生長，得出Ruegeria sp.在保護珊瑚免受致病性弧菌感染方面的潛在作用。林國榮等[44]在對有無滸苔水華的海水養(yǎng)殖池塘中菌群組成分析發(fā)現(xiàn)，Marivita是無滸苔水華池塘中的優(yōu)勢菌群。傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖黑鯛腸道樣品中分支桿菌屬、腸桿菌屬、Romboutsia、腸球菌屬、乳球菌屬豐度具有顯著優(yōu)勢，其中豐度差異最高的分支桿菌屬，能導(dǎo)致分枝桿菌病，是一種海洋硬骨魚病原菌[45]，其中主要病原菌海洋分歧桿菌是一種產(chǎn)生慢性病的細菌，在某些情況下可能導(dǎo)致暴發(fā)性死亡[46]。Wilson等[47]研究尼羅羅非魚感染海洋分枝桿菌時脾臟黑素巨噬細胞中心反應(yīng)，得出感染海洋分枝桿菌的羅非魚黑色素瘤噬細胞MMCs中黑色素含量升高，其MMCs作為工具來確定魚的健康狀況[48-49]，分枝桿菌感染被描述為形成一種非常難以治療的慢性病。腸桿菌是腸道正常菌，但是部分也是條件致病菌，具有抗生素的固有和獲得性耐藥[50]，Seker等[51]報道了陰溝腸桿菌對健康鯔魚具有較強的致病性，可造成大量死亡。陳雪峰[52]等從浙江湖州羅氏沼蝦育苗場暴發(fā)的幼體大規(guī)模發(fā)病死亡新病害中分離確定的病原菌為陰溝腸桿菌，陰溝腸桿菌在幼體體內(nèi)進行了大量增殖，成為絕對優(yōu)勢種，進而導(dǎo)致幼體感染死亡。

本研究表明，不同黑鯛養(yǎng)殖模式形成不同的菌群結(jié)構(gòu)，池塘循環(huán)水養(yǎng)殖模式下黑鯛腸道中具有明顯差異的優(yōu)勢菌屬大多為有益菌，而傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖黑鯛腸道多為慢性致病菌或條件致病菌屬。魚類通過腸道微生物結(jié)構(gòu)改變來增強免疫能力是其適應(yīng)各自生境的一種手段，為此，獲得相關(guān)的研究結(jié)果，豐富對不同養(yǎng)殖模式微生物群落特征信息的了解，同時為循環(huán)水養(yǎng)殖新模式的推廣提供有力的科學(xué)依據(jù)。