羅可天，宋妙芳，吳桂芬，林 智

（廣州市越秀區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510055）

金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，能夠產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒。無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中均占較大比例。在美國，金黃色葡萄球菌每年大約引起185 000例食物中毒；在我國，20%～25%的細(xì)菌性食物中毒病例是由金黃色葡萄球菌引起的[1]，金黃色葡萄球菌成為僅次于沙門菌和副溶血桿菌的第三大微生物致病菌。我國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會于2013年發(fā)布《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）[2]，在國家標(biāo)準(zhǔn)中制定了金黃色葡萄球菌的限量標(biāo)準(zhǔn)[3]，金黃色葡萄球菌定量檢測是食源污染物監(jiān)測的檢驗項目之一。為了提高實驗室的金黃色葡萄球菌定量檢測能力，筆者所在微生物實驗室參加了2020廣州市疾控中心組織的金黃色葡萄球菌定量檢測質(zhì)控考核活動，現(xiàn)對質(zhì)控考核結(jié)果進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品

1.1.1 菌株

實驗對照菌株以金黃色葡萄球菌（ATCC25923）標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，表皮葡萄球菌（ATCC12228）標(biāo)準(zhǔn)菌株為陰性對照。

1.1.2 樣品

凍干粉末樣品1瓶（由廣州市疾病預(yù)防控制中心提供），代碼為2020WS00008，檢測項目為金黃色葡萄球菌定量。

1.2 試劑與儀器

Baird-Parker瓊脂平板、革蘭氏染色液、凍干兔血漿、血瓊脂平板、TSA平板、腦心浸出液肉湯均由廣東環(huán)凱生物科技有限責(zé)任公司提供，生理鹽水、無菌水由微生物實驗室制備，均在有效期內(nèi)使用。

生物安全柜（AC2-6S1，新加坡藝思高科技有限公司）；生化培養(yǎng)箱（SPX-150B-Z，上海博迅實業(yè)有限公司）；顯微鏡（OLYMPUSCH-2，日本奧林巴斯株式會社）。

1.3 實驗方法

樣品到達后立即于2～8 ℃冰箱保存，試驗前從冰箱中取出，使其達到室溫后開啟。然后按質(zhì)控考核活動的作業(yè)指導(dǎo)書對樣品進行處理。

1.3.1 樣品前處理

生物安全柜內(nèi)使用75%乙醇棉球?qū)Υ龣z樣品西林瓶外表面進行擦拭消毒，待75%乙醇揮干后，無菌打開西林瓶，立即加入無菌水2 mL對樣品進行水化，待溶解后吸出放入無菌三角燒瓶。用2 mL無菌水清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌三角燒瓶，重復(fù)4次。另吸取30 mL無菌水加入上述無菌三角燒瓶，充分混勻，制成樣品均液。

以無菌吸管吸取25 mL樣品均液，注于盛有225 mL生理鹽水無菌三角燒瓶中，充分混勻，制成1∶10的樣品均液。按以上操程序10倍系列稀釋樣品均液至1∶106。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無菌吸管。

1.3.2 樣品的接種

依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡球菌檢驗》（GB 4789.10—2010）中第二法[3]，吸取各稀釋度樣品均液1 mL，分別以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種量加入3塊Baird-Parker瓊脂平板，然后用無菌涂布棒涂布。吸取各稀釋度樣品均液0.9 mL，分別以0.3 mL、0.3 mL、0.3 mL接種量加入3塊Baird-Parker瓊脂平板，然后用無菌涂布棒涂布。

1.3.3 培養(yǎng)

將兩組不同接種量的Baird-Parker 瓊脂平板室溫放置10 min，待菌懸液被充分吸收后翻轉(zhuǎn)平板，倒置后置于（36±1）℃，培養(yǎng)48 h。

1.3.4 菌落計數(shù)及鑒定

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡球菌檢驗》（GB 4789.10—2010）中第二法對Baird-Parker瓊脂平板上的典型菌落進行計數(shù)和確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)

培養(yǎng)48 h后，樣品在Baird-Parker瓊脂平板上生長的菌落形態(tài)特征一致，均有圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈，符合金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)的典型特征。

2.2 血漿凝固酶試驗

分別挑取兩組不同接種量在1∶10稀釋度的BP瓊脂平板上各5個菌落進行鑒定試驗血漿凝固酶試驗（同時采用表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株做對照），10個疑似菌落血漿凝固酶試驗均為陽性，同時劃線接種到血平板（36±1）℃培養(yǎng)24 h，血平板上均為較大、圓形、光滑、凸起、濕潤、金黃色的菌落，菌落周圍可見完全透明溶血環(huán)。

2.3 染色鏡檢

均為革蘭氏陽性球菌，排列是葡萄球狀，根據(jù)檢測結(jié)果及報告原則，兩種不同接種量的鑒定結(jié)果均為檢出金黃色葡萄球菌 1.6×103CFU/mL（表1）。

表1 金黃色葡萄球菌在BP平板上菌落計數(shù)記錄情況

3 結(jié)論與討論

在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中，金黃色葡萄球菌定量檢驗是常規(guī)檢驗項目，是微生物致病菌定量檢測質(zhì)控考核的常見項目，參加實驗室質(zhì)量控制考核活動可作為一個外部監(jiān)控指標(biāo)，提示室內(nèi)質(zhì)控難以發(fā)現(xiàn)的偏差或系統(tǒng)誤差，促進實驗室的改進工作，提高檢測質(zhì)量，是判斷和監(jiān)控實驗室能力的有效手段[4]。在實驗的過程中，應(yīng)注意以下問題：①在正式開始實驗前對所用的試劑和培養(yǎng)基進行驗證試驗，確保試劑和培養(yǎng)基的質(zhì)量符合試驗要求；②樣品從冰箱取出后，應(yīng)放置至室溫，進行水化必須靜置足夠的時間，以保證樣品充分溶解；③熟練掌握稀釋技術(shù)，避免稀釋的樣液不成梯度或者不均勻造成結(jié)果的偏差；④Baird-Parker瓊脂平板使用前可放在培養(yǎng)箱內(nèi)干燥，以消除平板表面的水珠，接種后應(yīng)盡快涂布，避免形成菌團，涂布時L棒盡量不要涂到平板邊緣造成蔓延生長；⑤血漿凝固酶試驗必須同時做陽性和陰性對照，且每30 min觀察1次，觀察6 d。由于葡萄球菌如果產(chǎn)生大量的葡萄球菌鏈激酶可以溶解纖維蛋白凝塊，誤判為陰性。為降低假陰性的發(fā)生，可延長觀察時間以確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。

本次實驗采用了兩種不同接種量的方法，其檢測結(jié)果相同，由廣州市疾控中心審核評判檢測結(jié)果為合格。在實際工作中，采用食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)致病菌金黃色葡萄球菌的定量檢測BP法接種量為0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的方法需要在不同稀釋度的Baird-Parker瓊脂平板上不停切換接種量，容易出現(xiàn)差錯，而接種量0.3 mL、0.3 mL、0.3 mL的方法，操作簡單，對基層實驗室非仲裁檢驗工作具有實際意義。