羅 敏 付時雨

（華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州，510640）

木質(zhì)纖維（Lignocellulose）是地球上豐富可再生的生物質(zhì)資源，被人們用于能源、建材、家具以及化學品的生產(chǎn)。近年來，隨著綠色經(jīng)濟的興起，生物質(zhì)基液體原料、生物質(zhì)基可再生材料的研究和利用成為熱門研究課題，被人們所關(guān)注。木質(zhì)纖維資源傳統(tǒng)利用，主要是通過脫除木質(zhì)纖維中的木素，或者木素和半纖維素獲得紙漿或者纖維素產(chǎn)品；大部分脫除的木素和半纖維素被焚燒后為堿回收提供部分熱能，只有少部分的木素和半纖維素用于生產(chǎn)高值化產(chǎn)品[1]。實際上，生物質(zhì)中的半纖維素脫除或者保留對纖維素的降解與轉(zhuǎn)化，以及纖維素纖維的功能化具有重要影響。眾所周知，半纖維素是由多種糖基構(gòu)成的不均一聚糖，是影響生物質(zhì)組分分離的重要因素。在植物天然結(jié)構(gòu)中，木質(zhì)纖維細胞壁主要以纖維素為骨架物質(zhì)，半纖維素覆蓋在纖維素微纖絲表面并以氫鍵連接，半纖維素還與木素間以共價鍵連接，從而形成疏水結(jié)構(gòu)[2]，也就是半纖維素與木素形成的木素-碳水化合物復合體（LCC）。

當植物纖維用于化學法制漿時，原料中的木素需要盡可能多地脫去，使纖維易于分散，同時纖維素降解盡可能少，適當保留部分半纖維素[3]。當植物纖維用于生物煉制時，則主要是打開植物纖維致密結(jié)構(gòu)和聚合物的分子鏈，使纖維素、木素和半纖維素得到有效分離，然后纖維素糖化、發(fā)酵成為能源和化學品。如果要實現(xiàn)生物質(zhì)組分高效分離，并有利于纖維素后續(xù)利用，則需要深入研究半纖維素的降解產(chǎn)物，特別是半纖維素的降解模式與規(guī)律。無論是制漿過程，還是生物煉制過程，半纖維素降解和溶出伴隨葡萄糖醛酸的降解和轉(zhuǎn)化。本文將概述半纖維素的降解反應，并對糖醛酸和己烯糖醛酸的測定進行詳細介紹。

1 半纖維素堿性降解反應

不同植物材種中半纖維素聚糖類型和結(jié)構(gòu)不同，針葉木以聚半乳糖葡萄糖甘露糖為主，而闊葉木以聚-O-乙酰基-4-O 甲基葡萄糖醛酸木糖為主[4]。各類半纖維素聚糖在堿性條件下會發(fā)生降解反應，可根據(jù)反應條件和程度分為堿性水解和剝皮反應。在較為劇烈的反應條件下與纖維素水解類似，如170℃、10%NaOH 溶液中，半纖維素糖苷鍵水解斷裂形成小分子糖基和糖醛酸基。在較為溫和的反應條件下，半纖維素會發(fā)生剝皮反應[5]，生成新的短鏈多聚糖，其上含有不均一的還原性末端基（即異變糖酸基），而降解下來的末端基在堿液中進一步互變異構(gòu)轉(zhuǎn)變成乳酸等降解產(chǎn)物。

降解產(chǎn)物中含有大量甲酸、乙酸以及20 種以上的羥基羧酸、16 種以上的羥基二元酸和不飽和酸[6]。當還原性末端基轉(zhuǎn)變?yōu)槠兲撬峄鶗r，剝皮反應終止，不再進行半纖維素的降解。除了化學降解，半纖維素的溶解也受到傳質(zhì)效應的控制，水解產(chǎn)物中的木素降解產(chǎn)物也會阻礙半纖維素的溶解[7]。

在堿性制漿蒸煮中，4-O-甲基葡萄糖醛酸基（meGlcA）易于脫除，因此蒸煮后所得到的半纖維素聚木糖鏈支鏈減少，聚合度降低，容易隨著堿液參數(shù)變化而發(fā)生變化。4-O-甲基葡萄糖醛酸在蒸煮液中受到高溫強堿（OH-）的作用，發(fā)生β-甲醇消除反應形成雙鍵，生成4-脫氧-己烯糖醛酸（HexA），反應過程如圖1 所示。HexA 在堿性條件下相對穩(wěn)定，可以阻止聚木糖分子鏈發(fā)生剝皮反應，但隨著蒸煮時間增加，HexA 會發(fā)生部分降解，同時，由于其對酸不穩(wěn)定，易被水解成呋喃衍生物[8]。在后續(xù)紙漿漂白過程中，會與漂白試劑發(fā)生反應，從而增加漂白試劑的消耗。在制漿中，蒸煮方法和堿液濃度會影響紙漿中最后殘留的HexA 含量[9]。由于針葉木中所含聚4-O-甲基葡萄糖醛酸木糖較少，其產(chǎn)生的HexA 也相應較少。每10 μmol/g 的HexA 對卡伯值的貢獻為0.84～0.86，在硫酸鹽法蒸煮中，針葉木的HexA 含量約為20～30 μmol/g，闊葉木則為50～60 μmol/g[10]。

圖1 堿性蒸煮下HexA的形成[10]Fig.1 Formation of HexA after alkaline cooking[10]

2 降解產(chǎn)物的測定方法

在生物煉制過程中，要提高生物質(zhì)組分的分離效率，需要測定其在分離過程中的降解產(chǎn)物含量和分布，以實現(xiàn)纖維素能源轉(zhuǎn)化或者材料制備。如前所述，半纖維素在制漿蒸煮中有很大程度的殘留，保留的半纖維素含有糖基、糖醛酸、HexA 等成分。研究人員為了測定這些成分做了許多重要的研究，其中甲基葡萄糖醛酸的降解轉(zhuǎn)化和HexA 的產(chǎn)生備受關(guān)注，其定量測定十分重要，下面將重點介紹其測定方法。

2.1 糖醛酸類物質(zhì)的測定

2.1.1光譜法

糖類物質(zhì)一般不具備紫外吸收或熒光基團，較為常用的方法是將其衍生化后使用比色法測定。此方法測定的優(yōu)點是快速顯色、方便快捷、對儀器設(shè)備要求較低，適宜于大批量樣品分析，但存在衍生化后產(chǎn)物不穩(wěn)定，測量結(jié)果誤差較大，并且容易受中性雜質(zhì)干擾等缺點。

糖醛酸（葡萄糖醛酸）與濃硫酸在沸水浴條件下能夠發(fā)生水解反應，生成呋喃化合物5-甲?；?2-呋喃甲酸（5FF）[11]，水解產(chǎn)物再與顯色試劑反應能夠生成具有顯色基團的化合物，根據(jù)顯色基團的吸光度能夠測定出糖醛酸的含量。但是，樣品中存在的己糖和戊糖也會酸水解為5-羥甲基-2-呋喃甲酸、2-呋喃甲酸醛等產(chǎn)物，對糖醛酸測定造成干擾。常用的顯色試劑有咔唑、間羥基聯(lián)苯、3,5-二甲基苯酚等，根據(jù)不同的顯色反應發(fā)展了其相應的測定方法[12]。

咔唑-硫酸法通過咔唑與葡萄糖醛酸水解產(chǎn)物生成紫紅色化合物，其吸光度與葡萄糖醛酸濃度成正比，測定波長范圍在523～530 nm。Gregory[13]發(fā)現(xiàn)在濃硫酸中加入硼酸鹽能夠改變中間體的形成，增強葡萄糖和葡萄糖醛酸酮的羥甲基和羧甲基反應，進而加快顯色時間，增加顏色的穩(wěn)定性。李敏等人[14]采用改良咔唑-硫酸法測定糖醛酸的含量，在酸水解后采用冰水浴迅速冷卻的方法，延長了顯色體系的穩(wěn)定時間，有利于樣品的測定。需要注意的是，中性糖在加熱酸水解的過程中會發(fā)生褐變，對顯色反應造成較大干擾，特別是二次加熱，需要對測定結(jié)果進行校準。

間羥基聯(lián)苯法是通過葡萄糖醛酸與硫酸-硼砂溶液反應，水解產(chǎn)物與間羥基聯(lián)苯（MHDP）絡(luò)合顯色，生成粉紅色化合物，并利用比色法測定糖醛酸的含量。相較于咔唑-硫酸法，間羥基聯(lián)苯法可以在初次加熱水解糖醛酸后與MHDP在環(huán)境溫度下反應，避免了二次加熱，減少了中性糖的干擾。Filisetti等人[15]為解決加入MHDP 前第一次加熱過程中發(fā)生的褐變，在反應混合物中加入少量氨基磺酸鹽以消除褐變，而不會影響MHDP對糖醛酸的靈敏檢測，特別是當糖醛酸含量比中性糖少得多時。Albert 等人[11]研究了不同反應時間下MHDP/5FF 發(fā)色基團在520 nm 處的吸光度隨糖醛酸含量的變化，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)結(jié)果穩(wěn)定性差，需要在測定時建立新的方法以提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。林妲等人[16]探究了最佳反應條件，有效測定了堿分級分離提取所得半纖維素中葡萄糖醛酸的含量，并能夠保證顯色反應完成后2 h內(nèi)吸光度變化不大。

2.1.2色譜法

木質(zhì)纖維水解液中產(chǎn)物的色譜測定方法主要有氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）、離子色譜法（IC）等。GC 主要通過將產(chǎn)物衍生化后轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的物質(zhì)進行測定，衍生化過程往往較為復雜、重現(xiàn)性差，常用的衍生化方法有硅烷化、乙?；龋籋PLC 是采用聚葡萄糖凝膠色譜柱分離后測定成分含量，常與柱前/柱后衍生化反應與紫外或熒光檢測相結(jié)合，如還原胺化；IC 是利用待測組分電荷數(shù)差異在洗脫液中解離成陰離子后實現(xiàn)交換分離，操作簡單方便，且無需衍生化就可以進行檢測分析，檢測靈敏、準確度高、外在干擾小，且重現(xiàn)性好，但對儀器要求較高[12]。

常用的多糖產(chǎn)物測定方法是利用硫酸解聚處理，但α-(1→2)-糖醛酸和木糖殘基之間的連接鍵較為穩(wěn)定而不易斷裂，此外酸水解也會引起糖醛酸的脫羧反應。相比之下，酸性甲醇醇解法可以主要解聚非纖維素多糖鏈，從而更好地斷裂糖醛酸連接鍵，無需預先脫木素處理[17]。Chong 等人[18]利用酸性甲醇醇解法和氣相色譜法研究了樺木中4-O-甲基葡萄糖醛酸的含量，用鹽酸/甲醇溶液將糖醛酸樣品處理后，進一步三甲基硅烷化（TMSi），利用火焰離子化檢測器（FID）進行分析檢測，并使用核磁共振光譜測定的摩爾比作為純化標準品的定量。糖醛酸在酸性甲醇醇解過程中會發(fā)生部分內(nèi)酯化，從而在氣相色譜中產(chǎn)生6 個糖苷峰，與純化標準樣品的校準曲線結(jié)合，能夠更好地估計待測meGlcA的含量。

對于糖醛酸的衍生化反應使用最多的是還原胺化，反應原理是將糖的醛、酮等還原端羰基與伯氨基化合物反應，生成Shiff 堿結(jié)構(gòu)化合物后被NaBH3CN還原為仲胺，利用其紫外吸收或熒光進行檢測，常用于柱前衍生化后色譜分離檢測，葡萄糖與對氨基苯甲酸的反應過程如圖2所示。

圖2 葡萄糖與對氨基苯甲酸的反應示意圖[19]Fig.2 Schematic diagram of the reaction between glucose and p-aminobenzoic acid[19]

郝桂堂等人[19]利用柱前衍生高效液相色譜法，將氨基苯甲酸（p-AMBA）衍生化為反相離子后通過反相色譜柱分離檢測單糖及糖醛酸組成，對分離柱系統(tǒng)、流動相洗脫條件等進行分析，探究了適合p-AMBA 糖衍生物分離的色譜梯度洗脫分離程序，并優(yōu)化了反應溫度70℃和反應時間40 min等衍生化條件，達到了較高的分離檢測結(jié)果。Silva等人[20]同樣利用反向高效液相色譜熒光檢測法測定了中性糖和酸性糖含量，并提出衍生物的熒光檢測與流動相的pH 值有很強的相關(guān)性，將此法與傳統(tǒng)氣相色譜法-火焰離子化檢測法（GC-FID）對比分析，發(fā)現(xiàn)兩種方法對中性糖的檢測無顯著差異。

張強等人[21]采用陰離子交換與脈沖安培檢測法（PAD），建立了幾種單糖和糖醛酸的分離和定量分析方法，發(fā)現(xiàn)當洗脫液濃度為5 mmol/L、淋洗液流速為0.8 mL/min、柱溫為20℃時，分離度大于1.9，相對標準偏差小于3，可以在46 min 內(nèi)實現(xiàn)多種單糖和糖醛酸的完全分離，并且可以根據(jù)糖醛酸的酸度系數(shù)（pKa）值的不同，改變條件使其達到良好的分離效果。

Lorenzo等人[22]采用高效陰離子交換色譜（HPAEC）與紫外可見光檢測（UV/VIS）結(jié)合的方法，通過2-氨基苯甲酸（2-AA）對糖醛酸進行還原胺化，并與常規(guī)的磷酸-HPAEC 法和13C NMR 光譜相比，發(fā)現(xiàn)所檢測到的葡萄糖醛酸濃度有了極大提高，新方法比常規(guī)硼酸-HPAEC 法更靈敏，這表現(xiàn)在相比常規(guī)方法，測定的檢測極限要低很多。

Jacobs 等人[23]利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜（MALDI-MS）的檢測分析方法，研究了4-O-甲基葡萄糖醛酸殘基在木材聚木糖多糖鏈上的分布，并結(jié)合尺寸排阻色譜進行分析。結(jié)果表明，針葉木聚木糖的糖醛酸殘基主要規(guī)則地分布在每7 個或8 個木糖殘基上，而闊葉木聚木糖中的糖醛酸殘基分布不規(guī)則。各色譜法測定糖醛酸含量的條件對比見表1。

表1 色譜法測定糖醛酸含量的條件對比Table 1 Comparison of conditions for determination of uronic acid content by chromatography

2.2 HexA的測定方法

HexA 是制漿過程中糖醛酸殘基轉(zhuǎn)變而來的降解產(chǎn)物，它能與親電漂白試劑（如Cl2、ClO2、ClO3和過氧酸等）反應，從而影響后續(xù)漂白化學品的消耗，反應產(chǎn)物降解后會形成草酸鈣，使得管路和容器結(jié)垢[24]。此外，HexA 含有不飽和化學鍵，當用KMnO4測量紙漿卡伯值時會對測量結(jié)果產(chǎn)生影響，一些金屬離子容易與HexA 的雙鍵發(fā)生螯合而影響紙漿過氧化物的漂白性能[25]，其分子中的共軛雙鍵是一些發(fā)色基團的主要來源，會導致紙漿返黃。因此，對HexA 進行定量檢測和含量控制對制漿漂白工藝和提高紙張性能有重要意義[26]。

傳統(tǒng)的HexA 測量方法有聚木糖酶解核磁檢測法、酸化后紫外檢測法、乙酸汞水解液相色譜分離檢測法等，但實驗耗時長、實驗步驟繁瑣且不易控制反應條件[25]。本文將重點介紹近年來測定HexA 的改進方法，具有實驗方法簡便快捷、重復性高等優(yōu)點。

2.2.1水解法

汞鹽可以水解釋放2-乙酰氨基-2-脫氧-3-O-(β-D-蘇式-4-吡喃葡萄糖醛酸)-D-葡萄糖，此水解產(chǎn)物能夠吸收紫外光從而通過光譜法測定含量。Gellerstedt 等人[27]采用乙酸汞溶液選擇性水解HexA 和聚木糖鏈間的糖苷鍵，再用高碘酸鹽氧化形成3-甲酰丙酮酸后與硫代巴比妥酸反應生成紅色化合物，但實驗測定中水解緩沖液的紫外吸收較高，產(chǎn)生誤差較大；相比之下，氯化汞的紫外吸收較低，不易對HexA 的含量產(chǎn)生干擾。

Chai 等人[28]在前人的基礎(chǔ)上，提出了一種簡單快速測定HexA 的方法，利用氯化汞-乙酸鈉溶液高度選擇性水解HexA，在適宜的水解條件和溫度下能夠在30 min 內(nèi)完全水解HexA，然后通過紫外分光光度法在260、290 nm 處測定其含量。該研究還表明，紙漿漂白前后此法所得產(chǎn)物的光譜特征相同，表明木素等化合物對測定結(jié)果的影響較小，可通過雙波長分光光度法校正后得到準確測量數(shù)值，校正如式（1）所示。此法由于簡便迅速、樣品用量少，在2007 年被列入美國制漿造紙學會的標準檢測方法[25]。

式中，CHexA為HexA 的含量，μmol/g；A260、A290分別為260、290 nm 處的吸光度；V為水解液的體積，mL；w為紙漿樣品的絕干質(zhì)量，g；常數(shù)0.235為使用標準紙漿樣品獲得的校準系數(shù)[28]。

也有學者提出以氧化鎘溶液為水解液的UV 測定法[29]，測定波長為231、280 nm，并且可由含有HexA的聚木糖模型物的紫外吸收強度，計算得到氧化鎘溶液中HexA 的濃度，見式（2）。該方法是基于紙漿樣品在鎘試劑中的溶解，可以同時測定HexA 和殘余木素，其中木素的吸收必須從總吸收值中減去[30]。

式中，CHexA為HexA 的含量，g/L；A231、A280分別為231、280 nm 處的吸 光度；ε231、ε280分 別為231、280 nm下的吸收系數(shù)。

2.2.2酸解法

HexA 在與酸發(fā)生水解反應時，能夠形成呋喃-2-糠酸和5-羧基-2-糠醛，其產(chǎn)物含量分別是90%和10%，其反應過程見圖3。兩種產(chǎn)物分別在245、290 nm 處有紫外吸收。Jiang 等人[31]用陰離子交換色譜法分離呋喃酸產(chǎn)物后用抑制電導法定量，該方法耗時不超過4 h，重復性好，可用于各類化學漿中HexA的測定。Jiang等人[32]用同樣的檢測方法研究了傳統(tǒng)硫酸鹽漿和3種改性硫酸鹽漿（蒽醌漿、聚硫漿、聚硫蒽醌漿）中HexA 的酸水解動力學，結(jié)果表明，改性硫酸鹽漿中HexA 的酸水解具有非均相性，反應可分為兩個準一級動力學相，每個動力學相的速率常數(shù)不同。

圖3 HexA基團酸降解產(chǎn)物[33]Fig.3 Acid degradation products of HexA groups[33]

為了避免使用危險化學品，Zhang 等人[33]在N2條件下，用pH 值3.5 的甲酸/甲酸鈉緩存溶液在110℃下水解紙漿樣品1 h，通過紫外可見光譜法分析所得水解呋喃衍生物的吸光度，能夠確定HexA 的含量。此法溫和而環(huán)保，但未考慮木素等干擾物的影響，適用于漂白后紙漿中HexA 含量測定。詹懷宇等人[34]利用此法測定對比了不同木材原料的未漂常規(guī)硫酸鹽漿（CK）和改良硫酸鹽漿（EK）酸水解前后HexA 的含量，結(jié)果表明，針葉木（濕地松和加勒比松）漿HexA 含量一般為10～30 mmol/kg，闊葉木（尾葉桉、雷林桉）漿的一般為40～70 mmol/kg，約為針葉木漿的2～3倍，

Anna-Stiina 等人[35]提出了通過紫外共振拉曼光譜（UVRR）結(jié)合偏最小二乘法校正同時測定紙漿中木素和HexA含量的新方法，這是根據(jù)不飽和結(jié)構(gòu)C=O和C=C 的UVRR 條帶高度確定的，其他不飽和結(jié)構(gòu)含量在紙漿中是恒定的，因此該條帶高度與HexA 含量具有線性關(guān)系，與其他方法相比，此法較為快速，且樣品用量少，預處理過程簡單，操作簡便，不需要化學處理，但儀器成本高，適用于木素含量小于3%的半漂漿和全漂白紙漿。

不同材種原料用不同方法所測定的HexA 含量見表2。

表2 不同材種原料用不同方法所測定的HexA含量Table 2 HexA content of different materials determined by different methods

3 結(jié)語

長久以來，造紙行業(yè)的學者對制漿過程中的組分分離進行了大量研究，致力于清潔高效地制備紙漿，提升紙張質(zhì)量，并且探究木質(zhì)纖維的高值化利用，開發(fā)生物質(zhì)精煉新模式。半纖維素在制漿和生物煉制中起重要作用，這與半纖維素的溶出或降解對紙漿纖維的性能產(chǎn)生影響有關(guān)。對半纖維素的研究，需要探究其在植物纖維中的降解程度和降解機理，并分析其結(jié)構(gòu)、測定其含量。纖維原料，特別是闊葉木纖維，在高溫堿性蒸煮過程中，由于發(fā)生剝皮反應、氧化反應、水解反應，部分會降解成為低聚糖或單糖，這些糖類進一步降解得到的4-O-甲基葡萄糖醛酸及其堿性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物己烯糖醛酸，這是影響制漿工藝化學品消耗、制約下游纖維素加工利用的關(guān)鍵因素，對二者的結(jié)構(gòu)和含量變化進行分析測定，將對木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)性能和降解機理的探討提供指導，為改性生物質(zhì)基材料的研究提供新方法和新思路。