龔銘杰 黃 煒 施振華 王君祥

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是目前導(dǎo)致成年人群意外死亡的主要原因之一[1]。顱腦CT是臨床診斷TBI的基礎(chǔ)。Rotterdam CT評(píng)分對(duì)預(yù)測(cè)TBI預(yù)后有一定的臨床價(jià)值[2]。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致TBI 繼發(fā)性損傷的機(jī)制之一[3]。外泌體微小核糖核酸（microRNA，miRNA）可以通過模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptor，PRR）參與炎癥反應(yīng)[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)miR-212/132 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中呈高度表達(dá)，與突觸可塑性、記憶形成和神經(jīng)突生長(zhǎng)有關(guān)[6]。本文探討血漿外泌體miR-212、miR-132 水平與TBI病人損傷程度和Rotterdam CT評(píng)分的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 前瞻性收集2019 年3 月～2020 年10月收治的TBI 共76 例，其中男43 例，女33 例；年齡18～79 歲，平均（48.70±14.32）歲；交通事故傷36 例，高空墜落傷18例，異物打擊傷9例，其他原因13例；輕型19例，中型35例，重型22例。排除合并阿爾茨海默病、帕金森病、腦部腫瘤或其他器質(zhì)性腦綜合征等以及酗酒或?yàn)E用藥物病人。另外，選取我院體檢38例健康成年人作為對(duì)照，其中男21例，女17例；年齡18～78 歲，平均（49.80±15.91）歲。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血漿外泌體miR-212、miR-132 的檢測(cè) 收集全血樣本，2 h 內(nèi)以3 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min（4 ℃），收集血漿-80 ℃保存?zhèn)溆?。血漿解凍后，3 000 轉(zhuǎn)/min離心5 min，去除循環(huán)細(xì)胞或碎片。取上清液50 μl，加入外泌體提取試劑10 μl，4 ℃孵育30 min，然后室溫1 000 g離心10 min，使用緩沖液重懸沉淀，得到血漿外泌體。使用電鏡觀察外泌體提取情況。免疫印跡法鑒定外泌體表面特異性抗原表達(dá)[7]。

取200 μl 血漿外泌體樣本，用TRIzol 試劑提取總RNA，PrimeScript First-Strand cDNA 合成試劑盒（日本Takara公司）逆轉(zhuǎn)成cDNA。取2.0 μl的cDNA模板和cDNAs PrimeScript RT Master Mix 試劑盒（日本Takara 公司）進(jìn)行PCR 反應(yīng)：95 ℃、15 min，94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，70 ℃、1 min，40 個(gè)循環(huán)。miR-212正向引物5'-GGCACCTTGGCTCTAGACTG-3'，反向5'-GTCGGTGGCCGTGACTG-3'。miR-132 正 向 引物5'-CGACCATGGCTGTAGACTGT-3'，反 向5'-GTCTCCAGGGCAACCGTG-3'。U6 和18S rRNA 作為內(nèi)源性對(duì)照。用2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 Rotterdam CT 評(píng)分 入院進(jìn)行腦部CT掃描，用于Rotterdam CT 評(píng)分[8]。初始CT 圖像通過醫(yī)學(xué)圖像歸檔和通訊系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)閱，并由2位專家獨(dú)立完成Rotterdam CT 評(píng)分：①基底池受壓程度；②中線偏移度；③硬膜外血腫；④腦室內(nèi)或蛛網(wǎng)膜下腔出血。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件分析；正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料采用Mann-Whitney U；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定結(jié)果 電鏡觀察外泌體呈圓形、橢圓形，具有完成的雙層脂質(zhì)包膜結(jié)構(gòu)，直徑在50～120 nm。免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD9、CD63 和CD81膜蛋白表達(dá)陽(yáng)性。見圖1。

圖1 血漿外泌體的鑒定

2.2 TBI 病人血漿外泌體miR-212、miR-132 的變化與對(duì)照組比較，TBI 組血漿外泌體miR-212、miR-132水平明顯降低（P＜0.001，表1）。

表1 TBI病人血漿外泌體miR-212、miR-132水平變化

2.3 TBI 病人血漿外泌體miR-212、miR-132 水平與損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系 與輕型TBI比較，中、重型TBI組血漿外泌體miR-132 水平明顯降低（P＜0.05，表2）；與中型TBI比較，重型TBI血漿外泌體miR-212、miR-132水平明顯降低（P＜0.05，表2）。血漿外泌體miR-212（r=0.396）、miR-132（（r=0.716）水平與入院GCS評(píng)分呈明顯正相關(guān)（P＜0.001）。

表2 TBI 病人血漿外泌體miR-212、miR-132 水平與損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系

2.4 TBI 病人血漿外泌體miR-212、miR-132 水平與Rotterdam CT評(píng)分的關(guān)系 血漿外泌體miR-212水平（r=-0.375）和miR-132 水平（r=-0.613）與Rotterdam CT評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

TBI 的腦損傷包含兩個(gè)過程：急性損傷以及急性損傷結(jié)束后的慢性期（包含神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等過程）。TBI 后，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，釋放多種活性物質(zhì)，包括外泌體[9]。外泌體具有較低的免疫原性，可以穿透多種生物屏障，同時(shí)攜帶大量的特異性分子，為體內(nèi)的“通訊使者”[10]。研究表明，外泌體含有大量miRNA，為TBI的潛在生物標(biāo)志分子[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-212/132在大腦中呈普遍高表達(dá)，其靶基因（PDCD4、Ptgs2 等）可通過影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的再生、影響血腦屏障、樹突形態(tài)以及膠質(zhì)細(xì)胞的分化等過程參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[12]。miR-212、miR-132 都位于人類17 號(hào)染色體，具有一定的同源性，可以共同調(diào)控下游靶基因。Burek等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-212/132可抑制緊密連接蛋白，改變低氧條件下血腦屏障的通透性。Xu 等[14]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元分泌含miR-132的外泌體對(duì)維持腦血管的完整性具有重要作用。

Rotterdam CT 評(píng)分是臨床應(yīng)用比較廣泛的評(píng)分系統(tǒng)，包含對(duì)中線移位、中腦基底池受壓、顱內(nèi)出血的位置等多個(gè)影像學(xué)特征的評(píng)估，這些指標(biāo)與顱內(nèi)壓升高密切相關(guān)?；壮氐氖軌撼潭仁穷A(yù)測(cè)TBI病人預(yù)后的重要因素，初次CT檢查時(shí)腦池缺失或不可見的病人，預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)增加近4倍[15]。顯著的中線移位是TBI 手術(shù)治療的指征，中線移位還與許多神經(jīng)后遺癥有關(guān)，中線移位是臨床評(píng)估TBI 嚴(yán)重程度的重要參數(shù)[16]。中線移位＞5 mm 的病人，手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)增大[17]。Rotterdam CT 評(píng)分還包含對(duì)腦出血情況的評(píng)估。李浩浩等[18]研究表明Rotterdam CT 評(píng)分增加與TBI 預(yù)后不良有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)TBI 病人血清外泌體miR-212、miR-132水平與Rotterdam CT評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)，提示血清外泌體miR-212、miR-132 水平在一定程度上反映TBI 病人的腦部影像學(xué)特征。此外，術(shù)前GCS 評(píng)分也與TBI 病人的預(yù)后顯著相關(guān)[19]。本文結(jié)果顯示TBI 病人血清外泌體miR-212、miR-132 與術(shù)前GCS 評(píng)分呈明顯負(fù)相關(guān)。隨著TBI病情的加重，血漿外泌體miR-132、miR-212 水平明顯降低。因此，我們認(rèn)為，血清外泌體miR-212、miR-132水平不僅能反映TBI病人腦部CT影像學(xué)特征，同時(shí)對(duì)病人短期預(yù)后預(yù)測(cè)也具有一定價(jià)值。

綜上所述，TBI 病人血漿外泌體miR-132、miR-212 水平明顯下降，并且隨著TBI 損傷程度加重和Rotterdam CT 評(píng)分增加而隨之降低。這提示血漿miR-132、miR-212可能是TBI潛在的生物標(biāo)記物。