鄺瑞彬,楊 護(hù),楊 敏,周陳平,黃炳雄,魏岳榮
(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州510640)
百香果屬于西番蓮科西番蓮屬的多年生常綠攀緣木質(zhì)藤本植物,原產(chǎn)于巴西、巴拉圭至阿根廷等南美洲國家,果汁酸甜,營養(yǎng)豐富,風(fēng)味獨(dú)特,集食用、觀賞及藥用價(jià)值于一身,具有十分廣闊的市場前景[1-4]。中國百香果自20世紀(jì)80年代初開始人工引種栽培以來不斷引種馴化和雜交選育,2019年初在廣東、福建、廣西、云南等各栽培區(qū)迅猛發(fā)展近3.3萬hm2,產(chǎn)量約達(dá)100萬t[5-6]。但是,近年來百香果莖基腐病發(fā)生嚴(yán)重,已成為百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素,南方產(chǎn)區(qū)春夏雨季(5—8月)尤其多發(fā),病重果園植株發(fā)病率達(dá)30%~40%,死亡率高達(dá)40%~60%。國內(nèi)百香果果園大部分以價(jià)廉的帶土杯裝扦插苗為主,存在帶病土傳播的風(fēng)險(xiǎn),使莖基腐病逐步蔓延傳播至廣東、廣西、福建等百香果主產(chǎn)區(qū),造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。百香果莖基腐病報(bào)道始于20世紀(jì)80年代末,病癥多發(fā)生在植株距離地面5~15 cm的莖基部,幼苗階段百香果感染后,莖基部會出現(xiàn)深褐色斑狀,莖基皮層會逐步變軟進(jìn)而腐爛、產(chǎn)生褐腐,其葉片發(fā)生萎蔫、黃化及脫落的情況,慢慢枝蔓枯萎乃至植株枯死[8-10]。早在20世紀(jì)90年代,李德富等[11]和鄭加協(xié)等[12]從百香果病株分離鑒定其病原菌為土傳真菌腐皮鐮刀菌(Fusarium sloani)和尖鐮孢(Fusarium oxyporum),兩者都是根據(jù)傳統(tǒng)菌株形態(tài)觀察鑒定。菌株形態(tài)觀察鑒定的方法存在一定的主觀性。近年來的百香果相關(guān)研究主要集中在其莖基腐病的田間病癥、防治栽培及技術(shù)研究方面[13-14];國外學(xué)者在巴西、南印度等地亦陸續(xù)分離并鑒定了侵染百香果的鐮刀菌,與國內(nèi)研究結(jié)果較為一致,但對病菌致病性檢測和防治等缺乏后續(xù)報(bào)道[15-16]。采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)[7,17-18],在病原菌侵染早期進(jìn)行準(zhǔn)確、快速科學(xué)鑒定百香果莖基腐病致病真菌,開展病菌致病性研究,采取針對性的防控措施,可有效防止病情蔓延,減少生產(chǎn)損失。
本研究在廣東省百香果主產(chǎn)區(qū)采集莖基腐病病株,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察與分子測序方法鑒定分離病原菌菌株,并對菌株進(jìn)行致病性檢測,同時(shí)檢測系列化學(xué)殺菌劑對病菌生長、形態(tài)及其致病性的影響,以期為后續(xù)百香果莖基腐病菌致病機(jī)理、百香果抗病育種等研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。
根據(jù)百香果莖基腐病典型病癥,在廣東省廣州、云浮、肇慶、茂名、河源等百香果產(chǎn)區(qū)田間采集百香果莖基腐病感染植株10個(gè)。參考Bueno等[16]的病原菌分離方法,各病樣取約6 cm病健交接處部位,在超凈工作臺依次用70%酒精和0.5%次氯酸鈉消毒,無菌水清洗。切取病部置于無菌馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)上,28℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)5~8天。經(jīng)2~3次培養(yǎng),純化后最終獲得了8個(gè)病原菌真菌菌株,置于4℃下儲藏備用。
經(jīng)單胞純化的病原菌菌株,分別置于馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)和康乃馨葉汁固體培養(yǎng)液(CLA)各自暗培養(yǎng)6天,記錄菌落顏色、形態(tài)及生長情況,用光學(xué)顯微鏡觀察病原菌的菌絲、分生孢子及厚垣孢子等形態(tài),初步鑒定百香果莖基腐病病原菌的種[19-20]。在形態(tài)學(xué)特征鑒定的基礎(chǔ)上對分離菌株進(jìn)行分子測序鑒定。接種待測菌株馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PD)震蕩培養(yǎng)3~5天,采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen,北京)提取病原菌的DNA。利用對分離菌株的核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域(rDNA-ITS區(qū)域)和鐮刀菌特異性引物翻譯延長因子1α基因(EF-1α序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物回收純化及測序。將獲得的rDNA-ITS區(qū)域和EF-1α序列與GENBANK數(shù)據(jù)庫(NCBI BlastN)進(jìn)行相應(yīng)序列的同源性比較分析,并選取數(shù)據(jù)庫中已知種名的近源鐮刀菌序列,利用DNAMAN和MEGA6.0軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化 樹 。ITS1(5’-3’):TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;EF-1αF(5’-3’):CGCCTTGCTATTCCACAT,EF-1αR:CAACATACCA ATGACGGTGA。PCR反應(yīng)體系25.0 μL:DNA模板1.0 μL,2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5 μL,上下游引物各1.0 μL,ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 1 min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR引物合成及PCR產(chǎn)物測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
按照柯赫氏法則進(jìn)行病原菌的致病性測定。在離體致病性檢測實(shí)驗(yàn)中,以‘臺農(nóng)1號’、‘黃金果’2個(gè)主栽且易感病品種的百香果為材料,選取苗期植株勻稱的枝條,每個(gè)處理取枝條3支,每支剪取約6 cm莖段6個(gè),用70%酒精進(jìn)行表面消毒,放置于無菌培養(yǎng)皿中,干凈刀片輕刮表皮,放置均勻菌塊在傷口處進(jìn)行接種[7]。不接種為對照,8個(gè)病原菌株系(FP1~FP8),共9個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6個(gè)莖段。將樣品置于恒溫培養(yǎng)箱,28℃暗培養(yǎng),每天觀察記錄,共觀察6天。根據(jù)莖稈感染程度劃分病情等級為5級。0級,莖稈無明顯侵染;1級,莖稈傷口處開始發(fā)生少量褐化;2級,傷口處褐化加重,向傷口兩側(cè)滲透約1 cm;3級,傷口處褐化面積擴(kuò)大約1.5 cm,可見明顯白色菌絲生長;4級,傷口處褐化面積擴(kuò)大約2 cm,白色菌絲生長較旺盛;5級,傷口處變褐潰爛,褐化面積擴(kuò)大約3 cm,白色菌絲生長旺盛。在活體檢測分離菌株致病性實(shí)驗(yàn)中,參考Silva等[21]的方法,培育健康粗壯的百香果扦插苗為植物材料,配制PD培養(yǎng)液,培養(yǎng)菌液3~4天,將孢子濃度調(diào)整至106孢子/mL;對百香果扦插苗采用傷口接種法進(jìn)行接種,清水為對照,3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)為10株。接種后常規(guī)管理,20~40天后觀察植株病情,根據(jù)果苗病癥記錄發(fā)病情況,計(jì)算發(fā)病率,如式(1)。切取果苗發(fā)病株的感病莖基部組織,同上述分離純化,采用形態(tài)觀察法和分子鑒定進(jìn)行再次確認(rèn)。
選取常規(guī)殺菌劑8種(99%惡霉靈、45%咪鮮胺、80%烯酰嗎啉、33%春雷王銅、30%苯甲嘧菌酯、60%霜脲嘧菌酯、12%甲密甲霜靈、24%噻呋酰胺),無菌水配制好母液,按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)稀釋成設(shè)定目標(biāo)濃度10倍的藥劑濃度備用,用0.45 μm過濾后,按比例加入約40℃PDA混勻制成測試平板。直徑8 mm均勻菌塊(strain FP6)接種到每個(gè)平板中央放置,28℃暗培養(yǎng)8天,每2天記錄生長情況。以常規(guī)PDA為對照,共9個(gè)處理,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),采用十字交叉法測量菌落直徑,并計(jì)算抑菌率[21],如式(2)。在離體實(shí)驗(yàn)中,選取成熟勻稱的百香果枝條,剪取約6 cm莖段,70%酒精進(jìn)行表面消毒,放置于無菌培養(yǎng)皿中,無菌刀片輕刮表皮,再用設(shè)定濃度的殺菌劑噴灑表面,風(fēng)干后放置均勻菌塊在傷口處進(jìn)行接種。不接種和無菌水處理為對照,共10個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)6個(gè)莖段。將樣品置于植物恒溫培養(yǎng)箱(28℃),每2天觀察記錄,共觀察6天,記錄處理莖段的病菌侵染情況(同1.3)。
采用Excel 2007軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,SPSS 19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,采用Duncan新復(fù)極差法分析顯著性水平,P<0.05差異顯著。
2.1.1 百香果莖基腐病田間癥狀 百香果莖基腐病多發(fā)生在高溫多雨季節(jié)的陰蔽果園,主要從根、莖基部傷口入侵,病癥多發(fā)生于距離地面5~15 cm的莖基部位置。受感染的百香果莖基部初期會出現(xiàn)斑塊狀褐色或深褐色部分,逐步地其莖基表皮層就會變軟,產(chǎn)生褐腐,陰濕病園病株莖基部常見灰白色菌物,并產(chǎn)生腐爛霉臭味道,病株莖部表面橫切面木質(zhì)部可見褐黃至褐色病斑;其上部葉片逐步發(fā)生萎蔫、黃化及脫落的情況,幼果發(fā)生萎縮和落果的現(xiàn)象,枝蔓逐漸枯萎乃至植株枯亡(圖1)。
圖1 百香果莖基腐病感染病癥
2.1.2 百香果莖基腐病原菌形態(tài)特征 在廣東省百香果主產(chǎn)區(qū)采集染病樣品10個(gè),利用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng),純化獲得8個(gè)真菌菌株,并利用光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)特征。結(jié)果顯示,在PDA培養(yǎng)基多產(chǎn)孢子,CLA培養(yǎng)基則可觀察到分離菌的不同生長形態(tài),如菌絲、分生孢子及厚垣孢子等。在PDA培養(yǎng)基中,不同的菌株樣品中,鐮刀菌形態(tài)略有差異(表1)。一般來說,分離菌落為氣生菌絲薄絨狀,呈白色、米白色或淺粉紅色,大型分生孢子為鐮刀型,一般為2~4個(gè)隔,大小為(45.3~185.2)μm×(12.1~18.5)μm,小孢子多為橢圓或長卵形,大小為(25.5~65.7)μm×(7.2~11.5)μm。各分離菌株呈典型的鐮刀菌真菌分生孢子,初步判斷為鐮刀菌真菌引起的病害(圖2)。
圖2 百香果莖基腐病原菌形態(tài)特征
表1 百香果莖基腐病原菌菌株形態(tài)
2.1.3 百香果莖基腐病原菌株分子鑒定 利用通用引物ITS1/ITS4可擴(kuò)增獲得長度為537~567 bp的片段。將測序所得序列進(jìn)行BLAST在線比對分析,發(fā)現(xiàn)其中分離獲得的8個(gè)菌株(FP1~FP8)的rDNA ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中多個(gè)腐皮鐮刀菌菌株對應(yīng)序列(Fusarium solani)(登錄號 MK734064.1、KY978584.1、MK734064.1、MH160786.1、MF782768.1等)的相似性高達(dá)100%(圖3)。根據(jù)鐮刀菌特異性引物翻譯延長因子1α基因(EF-1α序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將測序所得序列進(jìn)行對比分析,基于EF-1α序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果顯示,百香果莖基腐病菌菌株FP1~FP8與腐皮鐮刀菌(F.solani)的多個(gè)分離物聚為一個(gè)分支,以上菌株與尖孢鐮刀菌(F.oxyporum)菌株、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)菌株及輪狀鐮刀菌(F.verticillioids)分屬不同鐮刀菌分支(圖4)。通過形態(tài)特征觀察、分子生物學(xué)鑒定,分離獲得的百香果莖基腐病菌鑒定為腐皮鐮刀菌(F.solani)。
圖3 百香果莖基腐病原菌菌株基于ITS和EF-1a的PCR分子檢測
圖4 百香果莖基腐病原菌菌株基于EF-1a序列相似性構(gòu)建的鐮刀菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹
百香果致病性檢測實(shí)驗(yàn)采用離體及活體檢測2個(gè)方法。菌株離體接種致病性測定結(jié)果顯示,2個(gè)易感病品種(‘臺農(nóng)1號’(TN),‘黃金果’(HJG))接種1~2天后,接種部位開始出現(xiàn)淺褐色病斑;第3天后,病斑沿莖段呈條形擴(kuò)展,呈褐色水漬狀;第4天起,部分莖段枝條水漬腐爛,白色菌絲明顯(圖5)。根據(jù)莖稈受菌株感染程度劃分為5級,第6天統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,不同菌株在2個(gè)感病品種致病力反應(yīng)基本一致,在‘黃金果’中比‘臺農(nóng)1號’致病力更高。不同菌株致病性能力有差異,其中FP2、FP3、FP6和FP7的致病力較高。活體接種致病性測試結(jié)果顯示,接種2周后接種部位開始出現(xiàn)淺褐色或褐色病斑;接種30天后病斑逐步變大,莖基部變褐,植株葉片開始皺縮萎蔫;接種40天后,病株葉片凋落,部分植株枯黃甚至死亡(圖6)。菌株致病力在‘黃金果’中發(fā)病率高達(dá)50%以上,在‘臺農(nóng)1號’略低,發(fā)病率為10%~60%不等。FP6在‘臺農(nóng)1號’中發(fā)病率為最高為60%,在‘黃金果’中達(dá)90%,所以其致病力為最高。病菌致病力測試中,離體和活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致,綜合兩者,篩選出致病力較高的菌株為FP6、FP7、FP2,其次為 FP1、FP3、FP8和 FP4,最低為FP5。以上植株發(fā)病后從病斑上再次分離,獲得與接種病原菌相同的分離菌株。
圖5 百香果莖基腐病原菌菌株致病性測試(離體實(shí)驗(yàn))
圖6 百香果莖基腐病原菌菌株致病性測試(活體實(shí)驗(yàn))
為探究防治百香果莖基腐病菌,以8種常規(guī)殺菌藥劑為材料(表2),研究其對病菌(FP6)的生長及形態(tài)等影響,并在離體實(shí)驗(yàn)中觀察不同藥劑處理對接種病菌的抑制效果。結(jié)果顯示,T2對病菌生長抑制力顯著高于其他藥劑處理(95.56%),其次為T5、T6和T7,抑制率最低為T1和T8(表2)。在離體實(shí)驗(yàn)中,百香果莖段經(jīng)殺菌劑處理后,在傷口處進(jìn)行接種。結(jié)果顯示,不同藥劑處理后,T5處理后的病情等級最低,其抑制效果最佳,T2、T6、T7略遜色;T8、T4在早期有抑菌作用,但后期抑菌力較差;T1、T3抑菌效果最差。離體檢測與處理菌株生長形態(tài)的結(jié)果基本相符。建議栽培中避免長期、單一使用內(nèi)吸性殺菌劑,優(yōu)先選用殺菌劑苯甲嘧菌酯,適當(dāng)利用咪鮮胺、春雷王銅、霜脲嘧菌酯、甲密甲霜靈等混用或輪用,可有效治理百香果莖基腐病害。
表2 不同藥劑對菌株生長及致病力的影響
引起植物枯萎病(黃萎病、莖腐病等)的土傳真菌鐮刀菌屬大約由70個(gè)種組成,其中主要包括茄腐皮鐮刀菌(F.solani)、尖鐮孢菌(F.oxyporum)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、輪狀鐮刀菌(F.verticillioides)等,主要的致病真菌毒素包括鐮刀菌酸、白僵菌素、毛霉烯、伏馬菌素等;其主要危害包括植物致病性造成產(chǎn)量損失,產(chǎn)生真菌毒素污染及對人類和牲畜的健康造成影響[22-24]。百香果莖基腐病屬土壤鐮刀菌真菌引起的病害,在南美巴西、非洲、澳大利亞及韓國等東南亞國家與中國主產(chǎn)區(qū)如廣東、廣西、福建及海南等地均有報(bào)道,發(fā)病時(shí)間集中多在春夏多雨季節(jié),傳播速度快,防治困難,導(dǎo)致果園產(chǎn)量驟減,經(jīng)濟(jì)效益嚴(yán)重受損[6-7,13,15]。李德富等和鄭加協(xié)等[11-12]根據(jù)傳統(tǒng)菌株形態(tài)觀察鑒定其病原菌為腐皮鐮刀菌(F.sloani)、尖孢鐮刀菌(F.oxyporum);近年發(fā)展的分子測序手段在鐮孢霉屬真菌等真菌生物鑒定應(yīng)用上,大大提高了鑒定的準(zhǔn)確性和科學(xué)效率[18,24]。宋曉兵等[7]利用病原菌形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定測定,確定廣東西番蓮莖基腐病原菌為腐皮鐮孢菌(F.solani),但是只有一個(gè)樣本數(shù)量,尚欠缺代表性。本研究在廣東省百香果主產(chǎn)區(qū)田間采集莖基腐病病株樣品10個(gè),成功分離純化獲得8個(gè)真菌菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察法與分子鑒定方法對菌株鑒定,確定分離獲得的百香果莖基腐病菌鑒定為腐皮鐮孢菌(F.solani),與前人研究較為一致,與宋曉兵等結(jié)果相比更具代表性[7,11-12]。經(jīng)離體與活體實(shí)驗(yàn),對不同菌株進(jìn)行了致病力測試,篩選了致病性較強(qiáng)的3個(gè)菌株,為進(jìn)一步研究莖基腐病致病機(jī)理、防治措施和抗性育種等提供了材料基礎(chǔ)。本研究較為科學(xué)、全面地了解廣東省百香果產(chǎn)區(qū)莖基腐病的致病菌情況,為進(jìn)行百香果莖基腐病原菌早期鑒定及致病機(jī)理研究,開展針對性防控措施及抗性育種等研究提供材料和技術(shù)基礎(chǔ)。
百香果莖基腐病是百香果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大威脅,多雨季節(jié)常見于扦插苗幼苗期或2年期老苗植株,其傳染性強(qiáng),主要通過流通帶土病苗、雨水、農(nóng)田灌溉、農(nóng)耕工具、昆蟲咬食等途徑傳播,嚴(yán)重時(shí)田園植株枯黃死亡,顆粒無收。鐮刀菌真菌病害防治實(shí)踐中目前依賴于化學(xué)殺菌劑,如70%甲基托布津涂抹法、50%多菌靈可濕性粉劑、60%代森鋅等均有一定效果[13,26]。在本實(shí)驗(yàn)中,選取了8個(gè)殺菌藥劑,研究不同藥劑處理對菌株生長及致病力的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,30%苯甲嘧菌酯(1500倍)的抑制效果為最佳,其次為咪鮮胺、霜脲嘧菌酯、春雷王銅、甲密甲霜靈。初步田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,避免單一藥劑施用,采用幾種藥劑混用或輪用,可有效治理百香果莖基腐病害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是前人報(bào)道的有效補(bǔ)充,可為后續(xù)莖基腐病綜合防治提供理論基礎(chǔ)。
為了百香果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,建議百香果莖基腐病防治采用綜合防控手段。(1)防治應(yīng)以預(yù)防為主,種植前選擇適宜低緩坡地,對土壤施用適量石灰或石硫合劑進(jìn)行消毒,中和土壤酸度;增施腐熟有機(jī)肥和生物肥為底肥,增加有益菌群[27]。(2)建議選擇抗性砧木的健康嫁接苗,并減少帶土扦插苗傳播病害的風(fēng)險(xiǎn)。(3)適當(dāng)選擇通風(fēng)透光的搭架修剪模式,果園間作、輪作栽培。(4)及時(shí)疏通積水,建議地下水為水源的水肥灌溉措施。(5)均衡施肥,避免施用過量氮肥,花期及結(jié)果期適量補(bǔ)充鉀元素,提高抗逆性。(6)做好病源早期檢測與預(yù)防工作,利用70%甲基托布津、咪鮮胺、春雷王銅、苯甲嘧菌酯、霜脲嘧菌酯等化學(xué)藥劑進(jìn)行早期防治,嚴(yán)重病株要及時(shí)銷毀并清理出園,并做好消毒工作。(7)開展抗病育種研究,利用傳統(tǒng)與分子育種手段創(chuàng)制抗病新種質(zhì),改變百香果品種單一的局面,利用種內(nèi)生物多樣性控制病害[22,28]。
本研究利用形態(tài)學(xué)觀察與分子方法鑒定百香果莖基腐病菌,確定分離所得病原菌為腐皮鐮刀菌(F.solani);并對不同病原菌菌株的致病力進(jìn)行了測試篩選,在此基礎(chǔ)上,利用不同藥劑進(jìn)行處理,研究其對病原菌的生長及致病力的影響。本研究較為科學(xué)、全面地了解了廣東省百香果產(chǎn)區(qū)莖基腐病的致病菌情況,且篩選了效果較佳的防治藥劑,有效防止莖基腐病情蔓延傳播。不足之處在于,試驗(yàn)中致病菌均采集于廣東省百香果主產(chǎn)區(qū),其他產(chǎn)區(qū)如廣西、福建、云南等地的百香果菌株未涉及,所以數(shù)據(jù)結(jié)果未必適用于國內(nèi)其他產(chǎn)區(qū),在進(jìn)一步研究中,將擴(kuò)大樣品采集范圍,開展百香果莖基腐病病理學(xué)及綜合防控等相關(guān)研究,為解決百香果產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵技術(shù)難題提供基礎(chǔ)。