李國秋　張嘉雪　陳子錚　陳林耿　吳曉怡　張韌

【摘要】目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討“白術(shù)-茯苓”藥對抗胃癌（GC）的作用機制。方法：通過ETCM數(shù)據(jù)庫確定“白術(shù)-茯苓”藥對的有效成分，在Swiss Target Prediction平臺預(yù)測“白術(shù)-茯苓”藥對有效成分對應(yīng)的潛在靶點，并檢索Genecard、OMIM、Pharmgkb、TTD，Drug Bank等疾病數(shù)據(jù)庫，以獲得“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的作用靶點。通過Sting數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.2.1構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），通過Metascape平臺對“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC作用靶點進行KEGG通路分析。結(jié)果：從“白術(shù)-茯苓”藥對中獲得38個有效成分，62個與“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC相關(guān)的作用靶點，經(jīng)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC作用機制主要涉及“癌癥途徑（pathway in cancer）”、“類固醇激素合成（Steroid hormone biosynthesis）”，“過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路（PPAR signaling pathway）”等信號通路。結(jié)論：研究初步發(fā)現(xiàn)了“白術(shù)-茯苓”藥對通過“多成分-多靶點-多通路”模式發(fā)揮著抗GC的臨床作用，為“白術(shù)-茯苓”藥對配伍的深入研究提供了新的思路。

【關(guān)鍵詞】茯苓-白術(shù);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);胃癌;作用機制

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）23-0029-06

Study on the Mechanism of Baizhu-Fuling Herbal Pair for Anti-Gastric Cancer Based on Network Pharmacology

LI Guoqiu¹ZHANG Jiaxue¹CHEN Zizheng¹CHEN Lingeng¹WU Xiaoyi¹ZHANG Ren^2*

1. First Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China;

2. School of Fundamental Medical Science，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China

Abstract：Objective To study the mechanism of Baizhu-Fuling Herbal Pair for anti-gastric cancer based on network pharmacology.Methods The Baizhu-Fuling Herbal Pair active component was obtained by The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine Database （ETCM），the potential target of the active ingredient was predicted by the Swiss Target Prediction platform，and the disease target database such as Genecard，Pharmgkb，OMIM，TTD，Drug Bank was searched to obtain the target of Baizhu-Fuling Herbal Pair against gastric cancer.The PPI network was built with the help of the String database and Cytoscape 3.2.1 software.The target enrichment analysis of KEGG pathways were analyzed by Metascape database.Results A total of 38 active components and 62 Baizhu-Fuling Herbal Pair for anti-gastric cancer-related targets were screened from Baizhu-Fuling Herbal Pair.After enrichment analysis by KEGG pathway，it was found to regulate pathway in cancer，Steroid hormone biosynthesis，PPAR signaling pathway and other signaling path- ways. Conclusions Baizhu-Fuling Herbal Pair exerts anti-gastric cancer effects through a“multi-component-multi-target-multi-pathway” model，and provides a new idea for the in-depth study of the compatibility of Baizhu-Fuling Herbal Pair.

Key words：Baizhu-Fuling Herbal Pair; Network Pharmacology; Gastric Cancer;Mechanism

胃癌（Gastric cancer， GC）是中國常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)2018年2月國家癌癥中心發(fā)布的最新一期全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，GC的發(fā)病率和死亡率分列所有腫瘤類型的第2位與第3位^[1]。近年來，GC的發(fā)病率呈下降趨勢，新型生物制劑的研發(fā)和綜合治療策略的不斷發(fā)展，降低了GC的致死率，但GC的預(yù)后仍然不甚樂觀。中醫(yī)在控制癌癥病灶發(fā)展，延長患者生存期和改善生存質(zhì)量等方面表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，尤其是中藥可提高人體免疫，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的各組分，在腫瘤防治方面具有重要作用^[2]。

白術(shù)，味苦、甘、微辛，性溫，其用在中，主嘔逆泄利、去濕強脾、開胃進食、和中益氣?！侗静萃ㄐ吩唬骸鞍仔g(shù)，補脾胃之藥，得中宮沖和之氣，更無出其右者。土旺則能健運，故不能食者，食停滯者，有痞積者，皆用之也?！爆F(xiàn)代藥理研究^[3]發(fā)現(xiàn)，白術(shù)揮發(fā)油具有抗腫瘤、促進胃腸運動、調(diào)節(jié)胃腸功能、促進營養(yǎng)質(zhì)吸收的功能。茯苓，味甘，性平，主利水實脾，《神農(nóng)本草經(jīng)疏》記載：“中焦者，脾土之所治也。中焦不治故見膈中瘀水，腹脹大也，利水實脾，則其證自退矣?！爆F(xiàn)代藥理研究^[4-5]發(fā)現(xiàn)，茯苓中的多糖和三萜類成分可保護機體的免疫器官，增強機體免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制胃癌細胞生長，抑制癌細胞轉(zhuǎn)移，清除氧自由基。據(jù)目前相關(guān)文獻報道^[6]，“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的臨床療效顯著，但其具體作用機制尚未見系統(tǒng)闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，采用復(fù)雜的生物網(wǎng)絡(luò)模型，從藥物、化學(xué)成分、靶點、疾病間相互作用的整體性與系統(tǒng)性出發(fā)，預(yù)測藥物治療疾病的藥理學(xué)機制的一種方法，其與中醫(yī)治病的“整體觀”理論及中藥多成分、多靶點、多途徑、多作用的特點具有一致性^{[7- 8]}。故本研究將運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 “茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分獲取 中醫(yī)藥百科全書（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）是由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、中藥資源中心、北京大學(xué)中藥學(xué)院等大型單位打造的中醫(yī)藥數(shù)據(jù)平臺，該平臺收錄了403味中藥，7274個中藥成分等數(shù)據(jù)信息，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了強有力的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和分析平臺^[9]。

運用ETCM（ETCM， http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）檢索“白術(shù)”和“茯苓”兩者的藥物成分，同時記錄各成分對應(yīng)的“Pubchem ID”和“Canonical SMILES”。

1.2 “茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分對應(yīng)靶點獲取 通過Swiss Target Prediction平臺（http： //www.swisstargetprediction.ch /） 輸入1.1獲得化合物成分的的“Canonical SMILES”格式，預(yù)測“茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分對應(yīng)的作用靶點。

1.3 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的相關(guān)靶點收集 在Genecard數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）、Pharmgkb數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Drug bank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）輸入“gastric carcinoma”檢索GC相關(guān)的靶點，刪除其中重復(fù)的基因。將獲得的疾病靶點與1.2獲得的成分作用靶點進行比對，最后獲得“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的潛在作用靶點。

1.4 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的潛在作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein Protein interaction，PPI）構(gòu)建 在string數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），輸入“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的潛在作用靶點，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“medium confidence”，其余參數(shù)保持默認，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，通過Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選degree值排名前10的靶點。

1.5 KEGG通路富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1） 對“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC相關(guān)靶點進行KEGG通路富集分析，結(jié)合P值，從小到大排序，篩選出前10條通路，導(dǎo)出csv文件，對數(shù)據(jù)進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 “茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分收集 通過ETCM數(shù)據(jù)庫，一共獲得38個化學(xué)成分，其中白術(shù)14個、茯苓24個，見表1。

2.2 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC相關(guān)靶點 通過Swiss Target Prediction平臺，刪除重復(fù)靶點后得到69個“茯苓-白術(shù)”藥對藥物成分的作用靶點，接著將這 69個靶點與Genecard、OMIM、Pharmgkb、TTD，和Drug Bank 5個疾病數(shù)據(jù)庫收集到的GC相關(guān)基因靶點進行比對，最終得到62個“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的相關(guān)靶蛋白，見表2。

2.3 “茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的潛在作用靶點PPI分析 基于Sring數(shù)據(jù)庫的62個靶蛋白的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)，采用Cytoscape 3.2.1軟件繪制靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。此網(wǎng)絡(luò)共包括57個節(jié)點，143條邊（若兩個靶蛋白之間存在相互作用關(guān)系，則用邊連接兩個靶蛋白），靶蛋白degree值越大則節(jié)點越大。

同時利用Cytoscape 3.2.1軟件的篩選工具，篩選出該網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前10 的靶蛋白，分別為TNF、CYP19A1、AR、PPARG、AKR1C3、NR3C1、CYP17A1、HSD17B3、PTGS1、SRD5A1。

2.4 KEGG通路富集分析 采用Metascape平臺對“茯苓-白術(shù)”藥對抗GC的62 個作用靶點進行KEGG通路富集分析，篩選前10條目（P值從小到大進行排序），并且通過Excel對結(jié)果進行可視化處理。結(jié)果如圖2所示。主要通路有Steroid hormone biosynthesis、PPAR signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、Arachidonic acid metabolism、Nitrogen metabolism、Chemical carcinogenesis、Pathways in cancer insulin resistance、Regulation of lipolysis in adipocytes、Leishmaniasis。

3 討論

3.1 “白術(shù)-茯苓”藥對抗GC相關(guān)的重要藥物成分 本研究最終預(yù)測得到“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的38個活性化合物、62個潛在作用靶點及10條通路，其化合物多樣性、作用靶點多樣性及通路多樣性，從藥理層面及分子層面論證了中藥“同病異治，異病同治”原則。

現(xiàn)代藥理研究^[10]證實，白術(shù)化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、白術(shù)多糖、氨基酸等成分，這些化學(xué)成分有抗炎、抗腫瘤、提高機體免疫力、抗衰老、調(diào)節(jié)胃腸等藥理作用，茯苓中具有生物活性的化合物主要為三萜類和多糖類化合物，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗衰老、增強記憶力、調(diào)節(jié)泌尿系統(tǒng)、降血糖等^[11]。本研究中，白術(shù)-茯苓藥對篩選出的化合物含多種抗癌成分，如白術(shù)內(nèi)脂I、白術(shù)內(nèi)脂III、茯苓酸等，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能夠抑制MGC-803細胞的生長及繁殖，下調(diào)GC細胞表面標志物Hey1、CD44的表達，同時也包括抑制Notch信號通路，及降低Notch1、Hes1、Hey1和Jagged1蛋白的活性，從而有效地抑制GCMGC-803細胞的增殖^[12]。茯苓酸能抑制GC細胞的生長和克隆形成能力，顯著誘導(dǎo)細胞G2/M期停滯及細胞凋亡，同時調(diào)節(jié)一些凋亡相關(guān)蛋白如caspase-3，PARP， Bcl-2和Bax的蛋白表達，還能擾亂體外GC線粒體能力和抑制體內(nèi)GC移植瘤生長。

3.2 “白術(shù)-茯苓”藥對抗GC相關(guān)的重要作用靶點 在“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的PPI網(wǎng)絡(luò)中，TNF、CYP19A1、AR、PPARG、AKR1C3、NR3C1、CYP17A1、HSD17B3、PTGS1、SRD5A1在網(wǎng)絡(luò)中處于degree值前10名，是“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的重要潛在靶點。腫瘤壞死因子（TNF）分為兩種，分別為TNF-α和TNF-β，國外研究報道，GC患者血清中TNF-α水平明顯高于正常人群，手術(shù)切除GC組織后患者體內(nèi)血清中TNF-α水平明顯下降，但轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)者血清TNF-α水平再度顯著升高，該現(xiàn)象提示TNF-α與GC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)且起到促進作用^[13]。毛躍鋒等^[14]的研究表明參芪扶正湯能明顯降低Ⅲ～Ⅳ期GC患者血清中TNF-α、IL-6以及SIL-2R水平，與此同時亦能明顯提高患者的免疫功能，提高其生活質(zhì)量。有研究表明，雄激素受體（AR）在GC組織中高表達，且AR與年齡、性別、腫瘤大小、組織類型等均無明顯相關(guān)性。調(diào)節(jié)細胞周期諸多因素的關(guān)鍵角色是cyclinD1，而性激素可通過與其受體結(jié)合，介導(dǎo)某些直接或間接機制促進cyclinD1過度表達，從而促進腫瘤細胞增殖，此外性激素經(jīng)過胃腸道分解和肝內(nèi)代謝可轉(zhuǎn)變成低濃度的致癌物，與受體結(jié)合時可增強其與細胞核內(nèi)DNA的親和力，解除對DNA合成的抑制，恢復(fù)DNA聚合酶活性，促進細胞增殖，導(dǎo)致細胞惡性增殖的發(fā)生。

3.3 “白術(shù)-茯苓”藥對抗GC相關(guān)的重要生物通路 根據(jù)KEGG分析結(jié)果可知，“白術(shù)-茯苓”藥對抗GC的信號通路與“癌癥途徑（pathway in cancer）”最為相關(guān)，此外還涉及通路有“類固醇激素合成（Steroid hormone biosynthesis）”“過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路（PPAR signaling pathway）”“神經(jīng)活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）”“花生四烯酸代謝（Arachidonic acid metabolism）”“氮代謝（Nitrogen metabolism）”“化學(xué)致癌作用（Chemical carcinogenesis）”“胰島素抵抗（Insulin resistance）”“脂肪細胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)（Regulation of lipolysis in adipocytes）”。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，在激活狀態(tài)下參與調(diào)節(jié)許多與消化道腫瘤形成有關(guān)的基因，具有抑制增殖、促進凋亡、抑制細胞周期的進程等抗腫瘤作用，被認為是開發(fā)預(yù)防治療GC的重要靶點^[15]。張順榮等^[16]研究發(fā)現(xiàn)，胃復(fù)方含藥血漿可通過上調(diào)PPARγ基因表達的途徑來抑制 SGC-7901 細胞的增殖，促進其凋亡。有研究^[17]發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗與GC的患病相關(guān)，而GC患者普遍存在糖耐量異常和胰島素抵抗，這有可能是由于GC本身癌組織通過自分泌和旁分泌途徑產(chǎn)生一些生長因子，從而產(chǎn)生和加重一胰島素抵抗。另有研究^[18]認為，高胰島素血癥可加強胰島素樣生長因子（IGF-1）的合成，而IGF-1能夠促進細胞有絲分裂，抑制細胞凋亡，促進上皮細胞轉(zhuǎn)化，此外還可促進血管內(nèi)皮生長，因此增加了細胞惡性增殖的概率，減少腫瘤細胞的凋亡。

4 結(jié)論與展望

60%的GC患者手術(shù)或化療后會在2～3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，原因在于脫落和逃逸的腫瘤細胞會再次增殖并轉(zhuǎn)移，而化療藥物藥物對大多數(shù)腺癌缺乏敏感性，常因多藥耐藥導(dǎo)致治療失敗，或患者因無法耐受化療藥物的毒副反應(yīng)而中斷治療^[19-20]。研究^[21]證實，中藥治療GC具有多成分、多靶點、毒副作用小、防止術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等優(yōu)點。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選出“白術(shù)-茯苓”藥對潛在活性化合物，獲取其治療GC的潛在作用靶點， 從“成分-靶點-通路”研究藥物與疾病之間的相互作用規(guī)律，推測“白術(shù)-茯苓”藥對的藥效機理，初步闡釋了其治療GC的作用機制。但由于數(shù)據(jù)庫信息的不全面、化合物的濃度及化合物間的相互作用不明確等因素，使得預(yù)測結(jié)果有一定的局限性和片面性，需要更多的臨床試驗與動物實驗進一步去驗證。

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（收稿日期：2021-04-13 編輯：劉 斌）