金銀萍，郝巖，曲正義，郭靖，張浩※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春130118）

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱為北五味子。五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有收斂固澀、益氣生津及補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴和心悸失眠等癥[1]。臨床應(yīng)用于治療病毒性肝炎、慢性傳染性肝炎和肝硬化等肝系疾?。患甭灾夤苎?、支氣管哮喘等肺系疾??；心血管及糖尿病的治療[2]。但是，五味子研究熱點(diǎn)均集中在藥用部位果實(shí)，隨著研究的不斷深入，五味子藤莖被認(rèn)為是一種具有很大潛在藥用價(jià)值和可持續(xù)利用的藥用資源，具有多種藥理活性，包括保肝、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和抗炎等[3-7]。五味子藤莖獨(dú)具的特有氣味及豐富的營養(yǎng)成分也被用作調(diào)味劑和食品添加劑等。

五味子是一種多年生落葉藤本植物，果實(shí)為近球形或倒卵圓形的紅色漿果。由于野生馴化的影響，五味子的果實(shí)在果色、果粒形狀、果穗緊密度以及果粒表面的腺點(diǎn)密度等方面都存在廣泛變異，尤其是果色的變異尤為明顯，除存在粉紅色、紅色、紫紅色和紫黑色等類型外，還存在黃色及白色等類型[8-10]。近年有報(bào)道[11]五味子果實(shí)顏色的多樣性對(duì)其木脂素含量的影響，但是關(guān)于果實(shí)顏色多樣性對(duì)五味子藤莖化學(xué)成分的影響至今未見報(bào)道。本文探討了不同果實(shí)顏色的五味子藤莖中常見的有效成分的含量，并評(píng)價(jià)了不同果實(shí)顏色的藤莖樣品之間的定量和定性變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用2018年3月17日采自通化國家農(nóng)業(yè)科技產(chǎn)業(yè)園五味子優(yōu)良種苗示范推廣基地的藤莖樣本，白、黃、紅共3種果色的藤莖，每種采集3份，每份3個(gè)重復(fù)共計(jì)27份樣品。經(jīng)艾軍研究員鑒定為五味子科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的藤莖。D-無水葡萄糖對(duì)照品（純度≥99.5 %）購于北京化學(xué)試劑有限公司；齊墩果酸對(duì)照品（純度≥98.0 %）購于四川維克奇生物科技有限公司；沒食子酸（純度≥98.0 %）購于Acros公司；蘆丁和五味子醇乙（純度≥98.0 %）購于上海源葉生物有限公司；五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素對(duì)照品（純度≥98.0 %）購于中國食品藥品檢定研究所；色譜純乙腈、甲醇購于美國Fisher公司；純凈水購于杭州娃哈哈集團(tuán)，其他試劑為分析純。

1.2 儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Model Code UPB PDA檢測(cè)器；電子天平BSA 124S-CW（德國Sartorius公司）；KQ-500DE型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；ST-360酶標(biāo)儀（美國Biotek Epoch公司）；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 總?cè)频暮繙y(cè)定

1.3.1.1 供試品溶液的制備精密稱取五味子藤莖樣品2.0 g，粉碎過40目篩，將樣品放置于100 mL具塞三角瓶中，加入無水甲醇50mL，常溫超聲提取（500W，40 kHz）30 min，提取3次，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮至干，用無水甲醇將其定容至25 mL棕色容量瓶?jī)?nèi)，搖勻即得供試品溶液。

1.3.1.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對(duì)照品5.0 mg，甲醇超聲溶解定容至25 mL的容量瓶中，搖勻即得濃度為0.20 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品的含量測(cè)定精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL至5 mL的容量瓶?jī)?nèi)，氮吹儀吹干，然后精密加入5%香草醛-冰醋酸液0.2mL、高氯酸0.8mL，振蕩器上搖勻，60℃水浴15 min后，于冰水浴中放置5 min，取出，用冰醋酸定容至5.0 mL，搖勻即得系列齊墩果酸對(duì)照品溶液。按照相關(guān)文獻(xiàn)中的方法，于547 nm測(cè)定吸光值，以齊墩果酸的濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光值（y）為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]，見表1。

精密吸取供試品溶液0.5 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“至5 mL的容量瓶?jī)?nèi)”起依法操作，測(cè)定吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總?cè)频暮俊?/p>

1.3.2 木脂素的含量測(cè)定

1.3.2.1 對(duì)照品溶液的配制精密稱取各對(duì)照品適量，配成五味子醇甲、醇乙、甲素和乙素的混合對(duì)照品溶液，其質(zhì)量濃度分別為114.8g/mL、65.7g/mL、46.9g/mL和63.9g/mL。

1.3.2.2 供試品溶液的配制精密稱取五味子藤莖樣品2.0 g，粉碎過40目篩，將樣品放置在100 mL具塞三角瓶?jī)?nèi)，精密加入無水甲醇50 mL，超聲（500 W，40 kHz）提取，每次30 min共提取3次，過濾，濾液經(jīng)減壓濃縮至干，經(jīng)適量蒸餾水溶解后，用石油醚進(jìn)行脫色處理，萃取液棄去，水層減壓濃縮，用無水甲醇定容至25 mL棕色容量瓶中，搖勻，即得。

1.3.2.3 色譜條件及樣品的含量測(cè)定 采用ACQUITY UPLC BEHC18色譜柱（2.1mm 50mm，1.7m）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?~1 min，48~50%A；1~3 min，50~70% A；3~4.5 min，70~95% A；4.5~6.5 min，95%A；6.5~7.0 min，95~48%A；7~9 min，48%A；柱溫35℃，樣品溫度15℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量1.0L。結(jié)果表明，各對(duì)照品在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各木脂素的含量，樣品中總木脂素含量以五味子醇甲、醇乙、甲素和乙素的含量之和計(jì)算[13]。

1.3.3 總黃酮和總黃酮醇的含量測(cè)定

1.3.3.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品7.6 mg，于50mL容量瓶中用無水甲醇溶解定容，配制成0.152 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。經(jīng)適量無水甲醇稀釋成系列濃度梯度的蘆丁對(duì)照品溶液。

1.3.3.2 供試品溶液的制備 同1.3.1.1。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的含量測(cè)定 精密吸取120L的2% AlCl3乙醇溶液，加入120L的系列濃度蘆丁對(duì)照品溶液，混勻，室溫放置1.0 h，以不加蘆丁對(duì)照品的試劑作空白對(duì)照，于420nm處測(cè)定其吸光度值[14]。繪制蘆丁對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。精密吸取120L的2%AlCl3乙醇溶液，加入120L的系列濃度蘆丁對(duì)照品溶液，再加入160L的醋酸鈉溶液，混勻，室溫放置2.5 h，以不加蘆丁對(duì)照品的試劑作空白對(duì)照，于440 nm處測(cè)定其吸光度值[14]。繪制蘆丁對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

1.3.4 總酚的含量測(cè)定

1.3.4.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取沒食子酸5.0mg，于5 mL容量瓶中經(jīng)蒸餾水溶解定容，配制成濃度為1.0 mg/mL的沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，經(jīng)適量蒸餾水稀釋成系列濃度梯度的沒食子酸對(duì)照品溶液。

1.3.4.2 供試品溶液的制備 同1.3.1.1。

1.3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品的制備精密吸取系列濃度梯度的沒食子酸對(duì)照品溶液0.1 mL，依次加入0.5 mL的Folin&Ciocalteu's phenol reagent和1.5 mL 20%的碳酸鈉，混勻，用蒸餾水定容至10 mL的棕色容量瓶?jī)?nèi)，室溫放置2.0 h，以不加沒食子酸對(duì)照品的試劑作空白對(duì)照，于765 nm處測(cè)定吸光度[14]。繪制沒食子酸對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

表1 五味子藤莖各種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 1 The standard curves,correlation coefficients and linear ranges of the compositions from the stems of S.chinensis

1.3.5 多糖的含量測(cè)定

1.3.5.1 供試品溶液的制備精密稱取五味子藤莖樣品2.0 g，粉碎過40目篩，放置于250 mL軟底燒瓶中，加入50倍量的80%乙醇，冷凝回流提取2次，每次1.0 h，過濾棄去濾液，將藥材揮干后加入50倍量的蒸餾水，回流提取2次，每次2.0 h，過濾，合并濾液，濾液經(jīng)減壓濃縮至一定體積，加入乙醇進(jìn)行醇沉處理（醇沉濃度80%），4℃靜置過夜，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，無水乙醇洗滌兩次，干燥即得供試品多糖。供試品多糖經(jīng)蒸餾水溶解定容至100mL，即得供試品溶液。

1.3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及樣品的含量測(cè)定精密稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品10.0 mg于100 mL容量瓶中加水溶解定容，得0.10 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL的葡萄糖對(duì)照品溶液于10 mL具塞刻度試管中，用蒸餾水將其體積補(bǔ)至1.0 mL，加入6%苯酚溶液0.5 mL，搖勻，迅速加入2.5 mL濃硫酸，立即搖勻。室溫放置30 min，490 nm處測(cè)定樣品的吸光值[12]，繪制D-無水葡萄糖對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 總揮發(fā)油的含量測(cè)定精密稱取不同果色的樣品25 g置于1 000 mL的軟底燒瓶中，加入250 mL蒸餾水，經(jīng)揮發(fā)油提取器提取至不再有揮發(fā)油流出即可。將揮發(fā)油收集在密封離心管中，加入適量的無水硫酸鈉去除多余水分，然后置于棕色玻璃瓶中，于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。樣品揮發(fā)油的產(chǎn)量按每100 g干物質(zhì)中所得的體積數(shù)來表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用軟件SIMCA-P 14.0進(jìn)行主成分分析和聚類分析，使用Excel 2013進(jìn)行其他數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 成分分析

木脂素和多糖類等成分是五味子的主要活性成分，是其發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是五味子質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種選育需要考察的重要因素[16-19]。表2是27份五味子藤莖化學(xué)成分的測(cè)試分析結(jié)果，由表2可知，五味子藤莖化學(xué)成分中木脂素、多糖和揮發(fā)油的變異系數(shù)較大，說明這些成分存在明顯差異，遺傳多樣性比較豐富，可做為五味子藤莖質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要理化指標(biāo)。其中變異系數(shù)最大的是木脂素類成分，其也是歷代藥典評(píng)價(jià)五味子質(zhì)量的主要技術(shù)指標(biāo)，因此木脂素成分是五味子品種選育需要考察的重要因素之一。

表2 五味子藤莖主要化學(xué)成分的變異系數(shù)分析Table 2 The variation coefficient analysis of the main chemical compositions from the dried stems of

2.2 不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的含量分析

從表3和圖1可以看出，不同果色五味子藤莖的化學(xué)成分含量間存在明顯差異。其中白果五味子藤莖樣品中木脂素、三萜和黃酮醇的含量最高，分別高達(dá)0.611%、6.435%和0.600%。紅果五味子藤莖樣品中多糖和黃酮的成分含量較高，分別為8.370和0.567%。黃果五味子藤莖中酚類和揮發(fā)油的成分含量較高，分別為3.361%和1.920%。通過對(duì)不同果色藤莖樣本的測(cè)試分析，結(jié)果表明五味子藤莖種質(zhì)資源間化學(xué)成分含量的差異非常明顯。

圖1 不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的含量Fig.1 The contents of chemical composition from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

表3 不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的含量Table 3 The contents of chemical compositions from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

2.3 聚類分析

本研究采用HCA，根據(jù)化學(xué)成分的相似性來區(qū)分五味子藤莖種質(zhì)資源間的差異。聚類分析結(jié)果如圖2所示，27份來自不同果色五味子藤莖的樣品被分成了3個(gè)類群。白果的五味子藤莖能夠與另外兩種果色藤莖明顯地分開，兩者的落點(diǎn)距離在27左右，紅果和黃果藤莖樣品兩者間的落點(diǎn)距離也很遠(yuǎn)在14左右。因此，HCA能成功地用于不同果色五味子藤莖的種質(zhì)資源鑒定。

圖2 聚類分析圖Fig.2 The dendrogram of the cluster analysis

2.4 主成分分析

從得分散點(diǎn)圖及成分載荷圖3中可以看出，不同果色五味子藤莖的樣本能夠得到較好的分離，說明不同果色五味子藤莖間的化學(xué)成分存在明顯差異。通過PC1能夠優(yōu)先將白果藤莖與紅果藤莖及黃果藤莖分離開；而紅果藤莖和黃果藤莖之間能夠被PC2分離開，這個(gè)主成分分析結(jié)果與HCA的結(jié)果是一致的。

圖3 不同果色五味子藤莖化學(xué)成分的得分散點(diǎn)圖（左）及成分載荷圖（右）Fig.3 The scatter plots(left)and loading plots(right)from the dried stems of S.chinensis with different fruit colours

在PC1載荷圖中，三萜和木脂素類成分具有較高的正值，且成分貢獻(xiàn)率在90%左右，表明白果五味子藤莖中含有較高含量的三萜與木脂素類成分。在PC2載荷圖中，黃酮醇和多糖的成分貢獻(xiàn)均大于90%且具有較高的正值，表明紅果五味子藤莖中含有較高的多糖類成分，而白果五味子藤莖中含有高含量的黃酮醇類成分。

表4 化學(xué)成分的貢獻(xiàn)率Table 4 The contribution of chemical compositions

3 討論

從本文的研究中可以清晰的發(fā)現(xiàn)，不同果色五味子藤莖的化學(xué)成分含量差異顯著。在前人的文獻(xiàn)報(bào)道[20-24]中指出，五味子的化學(xué)成分含量受種類、品種、地理來源、氣候條件、采收加工及貯藏等因素的影響很大，而在我們的研究中，所有樣品都來自同一種植園，具有相同的地理來源和氣候條件，采收加工及貯藏等條件也一致。具有不同果色的五味子藤莖樣品之間化學(xué)成分的差異很可能更多地受基因型的影響而非環(huán)境因素的影響。這些化學(xué)成分的差異可為五味子藤莖種質(zhì)資源的鑒定以及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供理論參考。同時(shí)，亦可為五味子藤莖的資源利用與開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。