尚志福，鄭友琪，張濟(jì)顯，位竹君，張北方，張瑩

（東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

金花小檗（Berberis wilsonae Hemsl.）為小檗科（Berberidaceae）小檗屬植物，產(chǎn)于我國(guó)云南、四川、貴州、西藏和陜西。金花小檗根枝入藥可代黃連用，具有清熱、解毒和消炎的功效，用于止痢、赤眼紅腫等，也可用為飲料資源[1,2]，小檗屬植物三顆針為我國(guó)藥典收錄藥材[3]。研究表明，小檗屬植物含多種小檗堿類、酚酸類、黃酮類和有機(jī)酸類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗驚厥、降血壓、改善記憶和抑菌等多種藥理作用[4-8]。黃酮類化合物作為重要植物的次生代謝物，具有抗氧化等多種生物活性，在飲料等食品加工領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景[9-11]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)小檗屬植物的研究主要集中于根莖中的小檗堿類成分，對(duì)其他部位的研究相對(duì)較少，其中吳莉莉等[12]對(duì)產(chǎn)自黑龍江伊春的細(xì)葉小檗葉進(jìn)行了總黃酮測(cè)定，65%乙醇提取物的總黃酮含量可達(dá)0.513%；李金輝等[13]對(duì)采自貴州六盤水的威寧小檗根、莖、葉進(jìn)行了黃酮類化合物的含量測(cè)定和抗氧化活性研究，結(jié)果表明威寧小檗葉中的黃酮含量高達(dá)126.22 mg/g，且抗氧化活性最好；買爾旦·玉蘇甫等[14]對(duì)購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)喀什地區(qū)的喀什小檗果實(shí)研究表明，喀什小檗果實(shí)水提物具有非內(nèi)皮依賴性的舒張血管作用。金花小檗果實(shí)因相關(guān)研究開(kāi)展較少使其應(yīng)用受到限制。目前，小檗屬植物種子的研究多集中于發(fā)芽及幼苗更新[15-17]，關(guān)于金花小檗種子的化學(xué)和藥理學(xué)研究亦未見(jiàn)報(bào)道。本研究以乙醇為提取溶劑，應(yīng)用超聲輔助技術(shù)提取金花小檗種子中的總黃酮，在考察功率、體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度和超聲時(shí)間等單因素對(duì)總黃酮提取得率影響的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面（RSM）設(shè)計(jì)進(jìn)行提取參數(shù)的優(yōu)化，從而得到最佳提取工藝；再對(duì)金花小檗提取物的體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，從而為我國(guó)小檗屬植物的深入開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

金花小檗成熟果實(shí)于2020年10月采自西藏自治區(qū)林芝市八一鎮(zhèn)，室溫陰干至恒重后，經(jīng)手工分離獲得金花小檗種子；2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）、2,2'-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、2,4,6-三（2-吡啶）-1,3,5-三嗪（TPTZ）、2,2'-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）、水溶性維生素E（Trolox）購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

JP-100ST超聲波清洗機(jī)（深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司）；H1650醫(yī)用離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；752N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮提取將干燥的金花小檗種子粉碎并過(guò)60目篩備用。取0.1 g金花小檗種子粉末，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為提取溶劑，采用超聲輔助法提取總黃酮，提取結(jié)束后經(jīng)離心（10 000 r/min，10 min），吸取上清液備用?？傸S酮得率按式（1）計(jì)算：

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與總黃酮含量測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與樣品中總黃酮的檢測(cè)[15]。蘆?。≧T）標(biāo)液在0.036~0.360 g/L濃度區(qū)間內(nèi)與吸收值具有良好的線性關(guān)系，擬合方程為：y=1.280 6 x+0.083 6（R2＝0.997 7），依據(jù)樣品液吸收值和擬合方程計(jì)算樣品液及干樣品中的總黃酮。

1.3.3 單因素設(shè)計(jì)在功率400 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液固比30:1（mL/g）、提取溫度（30±2）℃和超聲時(shí)間20 min等固定條件下，每個(gè)因素設(shè)6個(gè)水平，其中在功率100~600 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)0~100%、液固比10:1~60:1（mL/g）、溫度30~80℃和超聲時(shí)間10~60min條件下，考察總黃酮得率對(duì)各單因素變化的響應(yīng)。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)為得到金花小檗果實(shí)總黃酮最佳提取參數(shù)，采用Box-Behnken法（Design-Expert 8.0.6版）進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)結(jié)果分析基礎(chǔ)上，選取對(duì)總黃酮得率影響較大的超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比等3個(gè)因素，以總黃酮得率為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸和優(yōu)化，并對(duì)最佳提取參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。響應(yīng)面設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.5 抗氧化能力評(píng)價(jià)依據(jù)張鶴等[18]的檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)樣品的DPPH自由基清除率，再根據(jù)清除率得出樣品的IC50值（半數(shù)抑制濃度）。依據(jù)文獻(xiàn)[18]的檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)樣品的Fe3+還原能力，以Trolox當(dāng)量表示樣品FRAP值。依據(jù)Xu等[19]檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)樣品的總自由基清除能力（TRAP），以Trolox當(dāng)量表示樣品TRAP值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理每組試驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Microsoft Excel 2010、Design-Expert 8.06和Origin 9.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)提取得率的影響由圖1（a）可見(jiàn)，超聲功率100~500 W時(shí)總黃酮得率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，超聲功率500~600 W時(shí)總黃酮得率略有下降。原因可能是一定條件下超聲波的空化效應(yīng)會(huì)加速黃酮類成分的釋放，總黃酮得率在500 W時(shí)最大，繼續(xù)增加功率，可能造成黃酮成分破壞，使總黃酮得率略有下降。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取得率的影響如圖1（b）所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在0~60%時(shí)總黃酮得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)相同，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)總黃酮得率達(dá)到峰值，繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，總黃酮得率逐漸迅速降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)總黃酮得率僅為13.17 mg RT/g。原因可能是金花小檗種子的主要黃酮類成分極性接近60%乙醇，乙醇進(jìn)一步提高，過(guò)多醇溶性和脂溶性雜質(zhì)溶出，使得總黃酮得率下降[20]。

2.1.3 液固比對(duì)提取得率的影響由圖1（c）可見(jiàn)，液固比為10:1~30:1時(shí)總黃酮得率隨液固比增大而迅速提高，在液固比為30:1時(shí)總黃酮得率達(dá)到峰值，液固比進(jìn)一步增大時(shí)總黃酮得率變化較小。原因可能是液固比適量增大使料液接觸更充分，促進(jìn)黃酮類化合物溶出；當(dāng)溶劑滿足溶質(zhì)溶解需要后，繼續(xù)增加溶劑量可能導(dǎo)致其他雜質(zhì)也被大量提取出來(lái)，且溶劑過(guò)多易導(dǎo)致后續(xù)濃縮等工藝中的總黃酮損失，導(dǎo)致目標(biāo)成分得率下降[21,22]。

2.1.4 提取溫度對(duì)提取得率的影響如圖1（d）所示，總黃酮得率在提取溫度為30~60℃時(shí)快速增加，60~70℃時(shí)增速變緩并在70℃時(shí)達(dá)到峰值，進(jìn)一步升高溫度時(shí)總黃酮得率略有下降。原因可能是黃酮類成分在乙醇溶液中的溶解度隨溫度升高而增大，但溫度過(guò)高又會(huì)破壞黃酮類化合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[23]，從而導(dǎo)致黃酮提取率下降。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)提取得率的影響由圖1（e）可見(jiàn)，超聲處理時(shí)間在10~40 min時(shí)，總黃酮得率隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而迅速提高，超聲40 min后總黃酮得率隨時(shí)間延長(zhǎng)呈小幅下降趨勢(shì)。原因可能是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致溶劑揮發(fā)增多，以及黃酮類成分氧化或分解[22]，從而使總黃酮得率在提取溶液體系達(dá)到傳質(zhì)平衡后開(kāi)始逐漸下降。

圖1 提取條件對(duì)總黃酮得率的影響Fig.1 The effects of different conditions on the yields of the total flavonoid

2.2 總黃酮提取參數(shù)的RSM優(yōu)化

2.2.1 RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取超聲功率（x1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（x2）和液固比（x3）為響應(yīng)變量，以金花小檗種子總黃酮得率為響應(yīng)值（y），應(yīng)用Box-Behnken法，進(jìn)行3因素3水平的提取參數(shù)響應(yīng)面優(yōu)化，見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 The Box-Behnken design and results

對(duì)表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析（表2），得到以金花小檗種子總黃酮得率y為因變量，以x1、x2、x3為自變量的回歸模型方程式（2）：

表2 方差分析Table 2 The analysis of variance

由表2的方差分析結(jié)果可知模型的F值=65.98（P＜0.000 1），達(dá)到極顯著水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)的P=0.190 5，不顯著，即模型的擬合度好；復(fù)相關(guān)系數(shù)（R2）為0.988 3，校正決定系數(shù)R2Adj為0.973 4，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值高度相關(guān)，可解釋97.34%的總黃酮得率響應(yīng)值變化。因此，所建模型的準(zhǔn)確性和可信度較高，可用于提取分析和預(yù)測(cè)總黃酮提取得率。

2.2.2 RSM結(jié)果分析由圖2 a可見(jiàn)，液固比為30:1時(shí)，等高線圖接近圓形，說(shuō)明超聲功率（x1）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（x2）的交互作用對(duì)得率的影響均不顯著[24]。由圖2 b可見(jiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，總黃酮得率隨功率提高而增加，在液固比加大情況下，總黃酮得率先降后升，且等高線為橢圓形，表明功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)之間具有交互作用。從圖2 c可知，超聲功率為500 W時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比提高，總黃酮得率均呈先增后降趨勢(shì)，等高線為近圓形，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比的交互作用對(duì)總黃酮得率影響不顯著。

圖2 不同提取變量相互作用對(duì)總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for interactions between three extraction parameters on extraction yields of the total flavonoids

2.2.3 最佳工藝條件與驗(yàn)證將實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶入軟件，分析得到最佳工藝條件：功率503W，乙醇體積分?jǐn)?shù)59%，液固比31:1，預(yù)測(cè)總黃酮得率最大值21.27 mg RT/g?？紤]到實(shí)驗(yàn)操作的便捷性，對(duì)預(yù)測(cè)得到的最佳工藝進(jìn)行小幅調(diào)整：功率500 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)59%，液固比30:1，提取溫度70℃，超聲時(shí)間40 min，在此條件下平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)得TF的得率為（21.36±0.26）mgRT/g，與預(yù)測(cè)值誤差小于1%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型關(guān)聯(lián)度較好，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果可信度高。

2.3 抗氧化活性

最佳工藝下得到的提取物分別檢測(cè)其DPPH自由基清除率、FRAP值和TRAP值（圖3）。由圖3 a可見(jiàn)，金花小檗提取物對(duì)DPPH自由基的清除率隨其質(zhì)量濃度的增大而逐漸提高，提取物質(zhì)量濃度為111mg/L時(shí)的自由基清除率可達(dá)54.65%，提取物對(duì)DPPH的IC50值為89.46 mg/L，Vc對(duì)DPPH的IC50值為3.45 mg/L。由圖3 b可見(jiàn)，金花小檗提取物質(zhì)量濃度與FRAP值和TRAP值之間也呈現(xiàn)出明顯的正相關(guān)關(guān)系；提取物質(zhì)量濃度為111mg/L時(shí)，F(xiàn)RAP值為19.69molTrolox/L，TRAP值為30.93 mol Trolox/L。

圖3 金花小檗種子提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)Fig.3 The antioxidant properties of the B.wilsonae seed extracts

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)金花小檗種子總黃酮的研究相對(duì)較少，對(duì)其優(yōu)化提取以及抗氧化方面的研究亦尚屬空白。該試驗(yàn)采用超聲輔助乙醇提取金花小檗種子總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)獲得優(yōu)化提取參數(shù)，得到最佳提取參數(shù)為超聲功率500 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)59%、液固比30:1（mL：g）、提取溫度70℃、超聲時(shí)間40 min，該條件下金花小檗種子總黃酮提取得率為21.36 mg RT/g；進(jìn)一步利用3種不同體外實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)提取物的抗氧化活性，金花小檗種子質(zhì)量濃度為111 mg/L時(shí)DPPH自由基的清除率可達(dá)54.65%，F(xiàn)RAP值和TRAP值以每克樣品的Trolox當(dāng)量表示，分別為19.69 mol Trolox/L和30.93 mol Trolox/L，為綜合開(kāi)發(fā)利用我國(guó)小檗屬植物資源提供了理論依據(jù)。