張 敏，許朵霞，王振華，郝 佳，楊煥月

（北京工商大學北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學 食品與健康學院，北京 100048）

米糠含有稻米中64%營養(yǎng)及人體所需90%必需營養(yǎng)素，可廣泛地應用于食品、醫(yī)藥、化工、化妝品等領域，是一種寶貴的可再生資源[1]。米糠含有15%～22%的油脂，不飽和脂肪酸占比高達80%，其中油酸與亞油酸之比約1∶1，是典型的油酸-亞油酸型植物油[2]。此外，米糠油中富含谷維素、維生素E、角鯊烯和植物甾醇等多種生物活性組分[3-4]，表現(xiàn)出極強的抗氧化作用，具有抑制腫瘤生長、降低人體膽固醇水平和葡萄糖耐量等生理功能[5-7]。因此，米糠油廣受消費者的喜愛。目前，機械壓榨法和溶劑浸出法是工業(yè)上常用的植物油提取方法。水酶法是以水代法為基礎，在特定條件下利用生物酶破壞細胞結構，促使油脂釋放的一種油脂提取方法。提取條件溫和、綠色安全、可同時分離出油脂和蛋白質等產(chǎn)品，是水酶法油脂提取的顯著優(yōu)勢。國內(nèi)外水酶法油脂提取，在大豆、菜籽、油茶籽、花生和芝麻等油料作物中有所應用，并取得了一定的成果[8-10]。1996 年Sengupta 等[11]首次利用果膠酶和纖維素酶，結合有機溶劑提取米糠油。Hanmoungjai 等[12]研究證實，應用Alcalase 2.4L 酶制劑可以顯著提高米糠油和蛋白質的提取率。楊慧萍等[13]對水酶法提取米糠油進行了工藝優(yōu)化，出油率達到85.76%。

水酶法油脂提取一般可將分為4 個階段：破碎、酶解、離心和破乳（如圖1 所示）。為提高出油率，通常應用加熱、微波、超聲波、擠壓膨化、酶法和蒸汽閃爆等[15-17]方式對原料進行預處理，破壞細胞結構。糖酶和蛋白酶則是水酶法油脂提取常用的酶制劑，糖酶主要包括纖維素酶、果膠酶、半纖維酶、淀粉酶和葡聚糖酶等[8,18]。選擇合適的酶制劑及酶解工藝，是水酶法油脂提取工業(yè)化應用的基礎。此外，在油脂提取過程中，磷脂、蛋白質和細胞碎片與油脂形成穩(wěn)定的乳狀液，導致油脂的提取率較低。受油料成分和性質的影響，不同油料形成的乳狀液性質差異顯著[19]。有效地破壞乳狀液的穩(wěn)定性，提高出油率及產(chǎn)品品質的破乳工藝，是目前國內(nèi)外水酶法油脂提取的技術瓶頸。本文開展水酶法提取米糠油的酶制劑篩選、酶解工藝及破乳工藝研究，創(chuàng)新米糠油水酶法提取的高效綠色節(jié)能制油技術，促進水酶法制油工藝在植物油脂行業(yè)的推廣與應用，實現(xiàn)米糠高值化利用，具有現(xiàn)實的理論價值和實踐意義。

圖1 水酶法提取米糠油示意圖[14]Fig.1 Principle of extracting rice bran oil by aqueous enzymatic method[14]

1 材料與方法

1.1 實驗材料

經(jīng)擠壓膨化保鮮的米糠（水分含量7.43%、脂肪含量18.45%、蛋白質含量12.69%）：黑龍江省樺川縣付士米業(yè)有限公司；Celluclast 1.5 L 纖維素酶（酶活力700 EGU/mL），Pectinex Ultra SP-L 果膠酶（酶活力26 000 PG/mL），Viscozyme L 糖酶復合酶（酶活力100 FBG/g），Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶（酶活力2.4 AU/g）：丹麥諾維信公司；Hemicellulase 半纖維素酶（酶活力0.3～3.0 unit/mg）：美國Sigma 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水酶法提取米糠油工藝及提油率測定

擠壓米糠粉碎過40 目篩，取100 g 米糠粉，按1∶6（w/v）加入超純水，90 ℃處理5 min 后，在一定的溫度和pH 值條件下，添加2%酶制劑400 r/min 攪拌酶解120 min。經(jīng)10 000 r/min 離心20 min 后得到游離油，按式（1）計算米糠提油率。

1.2.2 酶制劑的篩選

固定反應條件（料液比1∶6、加酶量2%、酶解時間120 min、攪拌速度400 r/min），考察Celluclast 1.5 L、Hemicellulase、Pectinex Ultra SP-L、Viscozyme L、Alcalase 2.4 L 等4 種糖酶和1 種蛋白酶在酶解適宜條件下（50 ℃、pH 5.0；50 ℃、pH 5.0；50 ℃、pH 5.0；45 ℃、pH 3.4；60 ℃、pH 9.0），米糠提油率的變化。設置不添加酶制劑的反應為對照組。

考察糖酶與蛋白酶復配對米糠提油率的影響。米糠混合液與1%糖酶作用60 min，再與1%Alcalase 2.4 L 作用60 min，其他處理與單一酶制劑處理相同。以添加單一蛋白酶Alcalase 2.4 L 為對照組。

1.2.3 酶解工藝的優(yōu)化

在單因素試驗、Packett-Burman（PB）試驗基礎上，以蛋白酶Alcalase 2.4 L 為酶制劑，從料液比、酶解時間、酶解溫度、加酶量、pH 值、攪拌速度等對提油率具有影響的因素中，篩選出料液比（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）3 個因素為自變量，米糠提油率（Y）為響應值，在加酶量2%，pH 值9.0，攪拌速度300 r/min 條件下設計三因素三水平的Box-Behnken 響應面分析試驗。試驗因素及水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken 試驗因素及水平表Table 1 Box-Behnken experimental design factor level codes

1.2.4 乳狀液的制備與成分檢測

取100 g 過40 目篩的膨化米糠粉，按1∶7.5（w/v）料液比加入超純水，90 ℃處理5 min 后冷卻至室溫。添加2%的Alcalase 2.4 L 酶制劑，在pH 值9.0、57 ℃條件下300 r/min 酶解150 min。反應結束后，離心收集乳狀液層。

參照羅紫-哥特里（Rose-Gottieb）法[20]測定乳狀液中油脂的含量，蛋白質及水分的測定采用國標方法。

1.2.5 破乳工藝的優(yōu)化

以室溫300 r/min 攪拌60 min 為基礎，不同時間（15、30、45、60、75、90 min）；不同溫度（20、30、40、50、60 ℃），確定乳狀液破乳工藝的基本條件。在優(yōu)化的破乳條件下（60 ℃下攪拌60 min），以未經(jīng)處理的乳狀液為對照組，分別在不同pH 值（2、3、4.5、5、7、9）、不同CaCl2溶液濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mol/L）、不同乙醇溶液濃度（10%、20%、30%、40%、50%）下進行破乳操作。攪拌結束后，離心收集游離油層，按式（2）計算乳狀液的破乳率。

1.2.6 粒徑及表觀狀態(tài)的測定

經(jīng)破乳處理后的樣品用超純水稀釋10 倍，充分混勻后，應用Microtrac S3500 激光粒度分析儀進行粒徑分析，設定油滴的折光指數(shù)（RI）為1.47，分散劑的RI 為1.333。

采用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）對破乳前、后乳狀液的微觀結構進行觀察。取2 mL 待測樣品，分別加入10 μL 的0.01%尼羅藍A（激發(fā)波長637 nm）和0.1%尼羅紅（激發(fā)波長488 nm）[21]，充分搖勻，制片后立即進行觀察。

1.2.7 米糠油品質的測定

按照參數(shù)優(yōu)化后的水酶法提取米糠油的工藝，制備水酶法提取米糠毛油。

使用有機溶劑在索氏抽提器中提取米糠油，經(jīng)減壓蒸發(fā)及氮吹去除殘留溶劑，獲得傳統(tǒng)有機溶劑法提取米糠毛油。

參考AOCS Official Method 方法測定油脂的酸價、碘值、皂化值、過氧化值、色澤等指標。蠟和磷脂含量的測定參照Pandey 等[22]的方法。采用高效液相色譜法測定維生素E 含量，氣相色譜法測定甾醇和角烯鯊含量[23-24]。谷維素含量采用LS/T 6121.1—2017 的方法測定[25]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有樣品進行三次平行試驗，試驗結果表示為平均值±標準偏差（SD），采用Origin 8.5 軟件和Design-Expert 8.0.6 軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，SPSS 17.0 軟件進行顯著性分析，其中不同字母（a、b、c）表示差異顯著（P＜ 0.05）。

2 結果與分析

2.1 酶制劑的篩選

受稻米品種、產(chǎn)地、加工方式等影響，米糠的化學組分含量一般波動較大。本研究的試驗原料來源于制米車間，品質相對純凈。

5 種單一酶制劑對米糠提油率的影響見圖2。由圖2 可知，酶制劑處理的提油率為28.59%～50.37%，無酶空白對照組，提油率為 21.30%～40.12%，堿性條件更有利于油脂提取。堿性蛋白酶Alcalase 2.4L 處理組的提油率最高，為50.37%；對照3（pH 值9.0）的提油率，顯著高于糖酶處理組的提油率。

圖2 單一酶制劑對提油率的影響Fig.2 Effect of single enzyme on the extraction yield of rice bran oil

Alcalase 2.4 L 提取米糠油的高效結果與Hanmoungjai 等[26]的結果一致。蛋白酶作用可破壞細胞的蛋白網(wǎng)絡和包圍脂質體的蛋白膜，增加蛋白的溶解性，從而釋放出更多的油脂[27-28]。堿性條件更有利于米糠油脂的提取，應該與蛋白質在堿性條件下的溶解度增加及游離脂肪酸的皂化作用，提高了油脂體在高pH 和低表面張力下的分離效率有關[29]。

糖酶與蛋白酶（Alcalase 2.4L）復配對米糠提油率的影響如圖3 所示。圖3 結果表明，糖酶和蛋白酶的復配不能提高米糠提油率。這些糖酶主要是水解纖維素、半纖維素、果膠等細胞壁的成分，破壞植物細胞結構的完整性，有利于油脂的聚集[8,18]。由于本研究中選用的米糠原料經(jīng)過擠壓膨化保鮮處理，細胞結構已被破壞，因此出現(xiàn)了糖酶對米糠油脂的釋放和提取影響不顯著的結果。糖酶復合酶與蛋白酶復配使用（Vis 處理組），出現(xiàn)了提油率降低的現(xiàn)象。這應該是聚集的油脂更多地進入了水酶體系的乳化液中，從而降低了游離油脂的含量造成的。

圖3 酶制劑復配對提油率的影響Fig.3 Effect of composite enzyme on the extraction yield of rice bran oil

2.2 酶解工藝的參數(shù)優(yōu)化

Box-Behnken 試驗設計及結果見表2。對表2數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到回歸方程：Y=64.99+3.12A+0.84B+1.30C+1.33AB–1.63AC+0.67BC–2.03A2–2.81B2–4.57C2。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 The design and corresponding results of Box-Behnken experimental

對模型進行方差分析，結果如表3 所示。由表3 可知，因素A、B、C的影響均極顯著，交互項AB、AC極顯著，BC顯著。

表3 Box-Behnken 試驗方差分析Table 3 Analysis of variance for Box-Behnken experimental design

利用數(shù)據(jù)分析軟件擬合水酶法提取米糠油的最優(yōu)條件：料液比1∶7.94，酶解時間149.86 min，酶解溫度57.02 ℃，理論提油率為66.52%。考慮到實際生產(chǎn)操作和成本問題，對參數(shù)進行修正：料液比1∶7.5，酶解時間150 min，酶解溫度57 ℃。進行驗證試驗，得到米糠提油率為66.24%±0.78%，與預測值基本一致。

2.3 破乳工藝的研究

水酶法制油后獲得的乳狀液主要成分含量如表4 所示，蛋白質約占2.1%，蛋白的存在對乳狀液的形成和穩(wěn)定起著主要作用[30]；油脂約占50.6%，即乳狀液中一半以上的物質是油脂?？梢姡瑢θ闋钜旱钠迫榧夹g開展研究，對提高水酶法提取米糠油提油率，具有重要意義。

表4 乳狀液的主要成分含量Table 4 Main compositions of the emulsion %

2.3.1 破乳條件的優(yōu)化

破乳時間對米糠乳狀液破乳率的影響見圖4。由圖4 可知，隨著破乳時間延長，破乳率逐漸提高；當破乳時間超過60 min 后，破乳時間增加對破乳率不會產(chǎn)生顯著影響。這種破乳率隨時間變化的規(guī)律與Jung 等[31]的研究結果一致。

圖4 破乳時間對破乳率的影響Fig.4 Effect of demulsification time on the demulsification rate

破乳溫度對破乳率影響的試驗結果見圖5。水酶法油脂提取的酶解溫度通常不超過60 ℃[19]，為節(jié)約能耗，設定60 ℃為最高破乳溫度。由圖5可知，加熱處理可有效提高乳狀液破乳率，60 ℃處理的破乳率可達71.23%。溫度升高，可以使乳狀液中粒子的布朗運動加快，減小乳狀液的粘度，加劇油滴的聚結，降低乳狀液穩(wěn)定性[32]。

圖5 破乳溫度對破乳率的影響Fig.5 Effect of demulsification temperature on the demulsification rate

2.3.2 破乳方法的選擇

經(jīng)蛋白酶處理后的乳狀液，初始 pH 值為8.3～8.6。調(diào)節(jié)體系pH 值對破乳率影響的試驗結果見圖6。由圖6 可見，酸性條件下，隨pH 值的升高，乳狀液的破乳率逐漸增加，pH 值為7 時，破乳率達93.15%；堿性條件下，破乳率與對照組差異不顯著，均顯著低于酸性處理。

有研究表明，調(diào)節(jié)水酶法提取大豆油的乳狀液pH 值3～4.5 時，乳狀液可以實現(xiàn)完全破乳，這是由于乳狀液的 pH 值接近大豆蛋白的等電點（pH=4.5），蛋白質發(fā)生聚集，促使油滴析出[33-34]。朱敏敏[35]在水酶法提取番茄籽油破乳工藝研究中發(fā)現(xiàn)，當乳狀液pH 值為11 時，番茄籽的出油率最高。

由此可見，調(diào)節(jié)pH 值破壞水酶法油脂提取乳狀液的穩(wěn)定性，對于不同油料研究結果存在明顯差異。這應該與油料組成與特性、粉碎方式及酶制劑等差異直接相關[36]。

CaCl2濃度對破乳率影響的試驗結果見圖7。圖7 結果表明，添加CaCl2溶液沒有提高米糠乳狀液的破乳率，反而呈現(xiàn)隨CaCl2濃度增加，破乳率減小的變化趨勢。

乳狀液界面蛋白質存在雙電層，可發(fā)生靜電排斥作用，使乳狀液保持穩(wěn)定，油滴無法聚集。當加入CaCl2溶液，解離的Ca2+可以中和蛋白所帶負電荷，破壞蛋白質的雙電層結構，促使油滴間聚集，導致破乳[33]。本研究結果與前人的研究結果不一致。原因可能是，Ca2+雖可促使蛋白質分子間發(fā)生交聯(lián)，但蛋白質交聯(lián)截留了大量油脂，導致破乳率降低[37]；同時也說明，破乳方法對不同油料乳狀液的破乳效果不盡相同。

添加乙醇對破乳作用的影響試驗結果見圖8。如圖8 所示，隨著乙醇濃度的增加，破乳率呈先升高后降低的變化趨勢。乙醇濃度為20%～30%時，破乳效果最好，破乳率達78.3%。

圖8 乙醇濃度對破乳率的影響Fig.8 Effect of ethanol concentration on the demulsification rate

乙醇屬于水溶性破乳劑，破乳機理在于乙醇的親水基團對構成界面膜的蛋白質親水端具有吸附力，從而破壞界面膜的穩(wěn)定性，使乳狀液失穩(wěn)，同時乙醇能夠使乳狀液中起乳化作用的蛋白質變性，實現(xiàn)乳狀液破乳、釋放油脂的作用[38]。當乙醇濃度超過30%時，破乳率降低，這可能與乙醇處理使油水兩相界面張力差異逐漸增大，導致破乳率變小有關[39]。

綜上研究，通過考察三種破乳方法對提油率的影響，確定調(diào)節(jié)pH值處理乳狀液為水酶法提取米糠油的破乳工藝。

2.3.3 pH 值對乳狀液的影響

乳狀液的粒徑大小及分布，可以直觀地反映破乳效果。pH值對乳狀液粒徑分布影響的試驗結果見圖9。對照組（未調(diào)節(jié)pH，乳狀液在60℃下破乳處理60 min）的粒徑呈雙峰分布，主要集中在1～10μm 和10～100μm 范圍內(nèi)，且1～10μm油滴占比86.5%±0.67%。這說明，對照組乳狀液中油滴較小且分布不均勻。隨著pH 升高，乳狀液中小油滴聚集、粒徑增大，破壞了乳狀液的穩(wěn)定性，粒徑呈單峰分布。

圖9 pH 值對乳狀液粒徑分布的影響Fig.9 Effect of pH value on particle size distribution of the emulsion

pH 值對乳狀液平均粒徑的影響見圖10。圖10 平均粒徑大小的數(shù)據(jù)圖可以更直觀地比較各樣品形態(tài)。未經(jīng)處理的對照組，平均粒徑最小，乳化液穩(wěn)定性好；酸性條件下，隨pH 值升高平均粒徑不斷增大，pH值7時，平均粒徑達到最大。結合圖4研究結果可知，乳狀液的平均粒徑與破乳率呈正相關。堿性條件下，乳狀液的平均粒徑顯著小于酸性處理的樣品，乳狀液穩(wěn)定性較好。粒徑分布結果同樣表明，堿性條件不利于水酶法提取米糠油乳狀液的破乳。

圖10 pH 值對乳狀液平均粒徑的影響Fig.10 Effect of pH value on mean particle size of the emulsion

乳狀液經(jīng)尼羅紅和尼羅藍A 染色后，通過CLSM觀察到的微觀結構及樣品表觀形態(tài)示意圖見圖11。a 圖和b圖可清晰看到乳狀液中呈綠色油相和紅色蛋白相的分布情況。a 圖初始乳狀液的小油滴分布均勻，同時表面被一層蛋白界面膜包裹。當調(diào)節(jié)pH 值7進行破乳處理后（b圖），油滴表面的蛋白膜被破壞，小油滴聚集為大油滴，粒徑明顯增大。c圖為酶解后離心去除游離油的乳狀液樣品表觀形態(tài)，d 圖可清楚地看到乳狀液經(jīng)過破乳離心后獲得游離油的狀態(tài)。

圖11 破乳前后乳狀液微觀結構及表觀狀態(tài)Fig.11 Microstructure and photographs of emulsion before and after demulsification

通過以上研究，確定水酶法提取米糠油最適工藝為，膨化米糠粉碎過40目篩，按1∶7.5（w/v）料液比加入超純水，90℃處理5 m in 后冷卻至57℃，添加2%的A lcalase 2.4 L 蛋白酶，在pH值9.0條件下300 r/m in 酶解150m in，1 000 r/m in離心20m in 后收集游離油層和乳狀液層。調(diào)節(jié)乳狀液pH值7.0，60℃下300 r/m in 攪拌60m in 破乳后，再次離心收集游離油層。此工藝獲得米糠提油率可以達到84.1%以上。

2.3.4米糠毛油的品質

未經(jīng)精練處理的水酶法與傳統(tǒng)有機溶劑法提取米糠毛油的理化指標見表5所示。由表5可以看出，水酶法提取的米糠毛油酸值略低，但二者差異不顯著；過氧化值較低，碘值、皂化值較高，油色較淺。蠟質和磷脂含量，水酶法提取的米糠毛油明顯較低；生物活性物質（維生素E、甾醇、角烯鯊和谷維素等）含量，則顯著高于有機溶劑法提取的米糠毛油。

表5 水酶法與有機溶劑法提取米糠毛油的品質指標Tab le 5 Physicochemical properties of rice bran oil obtained by aqueous enzymatic extraction and solvent extraction

可見，水酶法提取的米糠毛油具有較好的品質，其開發(fā)利用前景十分廣闊。

3結論

本研究開展了水酶法提取米糠油的工藝研究。通過酶制劑的篩選，確定A lcalase 2.4 L 蛋白酶為水酶法提取米糠油的酶制劑；糖酶無法提高擠壓米糠原料的提油率；堿性條件更有利于米糠油脂的提取。通過優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，在1∶7.5料液比、2%加酶量、57℃、pH 值9.0、300 r/min攪拌酶解150 m in 條件下，可獲得66.2%的米糠提油率。通過乳狀液的破乳條件和破乳方法研究，確定水酶法提取米糠油乳狀液的最佳破乳工藝：調(diào)節(jié)乳狀液pH 值至7.0，60℃條件下300 r/m in攪拌60 m in，破乳率可達93.15%；堿性條件及CaCl2處理，無助于水酶法提取米糠油乳狀液的破乳；20%～30%乙醇處理，可提高乳狀液的破乳率。應用本研究創(chuàng)制的水酶法提取米糠油工藝，可獲得84.1%以上提油率的米糠毛油，毛油品質特別是生物活性物質的含量，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑法提取米糠毛油。