董彩文，王明雷，白少怡，胡曉龍，王 悅，黃天琪

（1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002）

蜂蜜是工蜂采集開花植物的花蜜或蜜露以及自身的分泌物，在蜂巢中經(jīng)過(guò)充分釀造加工得到的純天然物質(zhì)[1]。蜂蜜酒擁有長(zhǎng)久的釀造歷史，既保留了天然蜂蜜的營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)使重要活性物質(zhì)如氨基酸、維生素和礦物質(zhì)的含量增加，因此具有良好的營(yíng)養(yǎng)功能[2-4]。

麥曲廣泛用于黃酒的釀造過(guò)程，并對(duì)黃酒的釀造和風(fēng)味起著重要的作用[5-10]。在蜂蜜酒的釀造過(guò)程中，大部分情況下用酵母進(jìn)行發(fā)酵[11-14]，很少使用酒曲，導(dǎo)致蜂蜜酒的風(fēng)味不足。在蜂蜜酒的發(fā)酵過(guò)程中使用酒曲和酵母，可以增加蜂蜜酒的風(fēng)味[15-16]。本實(shí)驗(yàn)把麥曲和酵母一起用于蜂蜜酒的發(fā)酵，經(jīng)過(guò)單因素考察了不同因素對(duì)酒精生成的影響，然后經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析得到酒精最高生成值，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)化發(fā)酵工藝的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

棗花蜜：河南省長(zhǎng)葛市；麥曲：蘇-16，江蘇省地方特產(chǎn)專營(yíng)店；酵母：高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；磷酸氫二銨（食品級(jí)）：江蘇科倫多食品配料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20 特勒-托利多實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫(yī)療機(jī)械廠；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LX-C35L 型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV9100 全自動(dòng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Lab Tech 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酒精度的測(cè)量

參照標(biāo)準(zhǔn)方法[17]，發(fā)酵結(jié)束后離心，取上清進(jìn)行酒精度的測(cè)定，并換算成 20 ℃時(shí)的酒精度。

1.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度為16.0%的蜂蜜液，80.0 ℃水浴20 min，冷卻。在超凈工作臺(tái)中將蜂蜜液依次倒入十個(gè)錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入麥曲10.0 g，酵母0.5 g，搖勻。分別在24.0、26.0、28.0、30.0、32.0 ℃條件下培養(yǎng)3 d。按照1.3.1 的方法進(jìn)行酒精度的測(cè)定。

1.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度為22.0%的蜂蜜液，80.0 ℃水浴20 min，取出冷卻。在超凈工作臺(tái)中將蜂蜜液依次倒入10 個(gè)錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入麥曲10 .0 g，酵母0.5 g，30.0 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間分別為3、4、5、6、7 d。按照1.2.1 的方法進(jìn)行酒精度的測(cè)定。

1.3.4 磷酸氫二銨添加量對(duì)酒精度的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度為22.0%的蜂蜜液，80.0 ℃水浴20 min，冷卻。在超凈工作臺(tái)中將蜂蜜液依次倒入 10 個(gè)錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次分別加入磷酸氫二銨300、600、900、1 200、1 500 mg/L，麥曲10.0 g，酵母0.5 g，30.0 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。按照1.2.1 的方法進(jìn)行酒精度的測(cè)定。

1.3.5 發(fā)酵液糖度對(duì)酒精度的影響

取適量蜂蜜和蒸餾水配制糖度為 16.0%、20.0%、24.0%、28.0%、32.0%的蜂蜜液，80.0 ℃水浴20 min，取出冷卻。在超凈工作臺(tái)中將蜂蜜液依次倒入10 個(gè)錐形瓶中，每瓶250 mL。然后依次加入磷酸氫二銨225 mg，麥曲10.0 g，酵母0.5 g，30.0 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。按照1.3.1 的方法進(jìn)行酒精度的測(cè)定。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化

在分別確定了單因素對(duì)蜂蜜發(fā)酵過(guò)程中酒精度生成的影響后，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取三個(gè)對(duì)酒精度生成影響較大的因素，然后在每個(gè)因素方向選取三個(gè)數(shù)值進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，如下表。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

1.4 數(shù)據(jù)分析

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 Microsoft Office Excel 2016 對(duì)其進(jìn)行分析，利用 Design Expert 10 軟件對(duì)工藝參數(shù)的組合進(jìn)行優(yōu)化，利用響應(yīng)面分析法（RSM）得到回歸模型和工藝參數(shù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平行試驗(yàn)的平均值，并利用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間方差分析，在 95% 的置信區(qū)間內(nèi)各組之間是否顯著，用相同字母表示不顯著，用不同字母表示顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)酒精生成的影響結(jié)果

溫度是發(fā)酵過(guò)程中酵母參與反應(yīng)的重要因素之一，發(fā)酵溫度對(duì)酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酒精有一定影響[14]。由圖1 看出，當(dāng)溫度從24 ℃上升到26 ℃時(shí)，酒精度隨溫度的升高而明顯上升，并達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)波動(dòng)。方差分析結(jié)果表明，24 ℃和26 ℃兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在95%水平下差異顯著，26、28、30、32 ℃四個(gè)試驗(yàn)組在95%水平下無(wú)顯著性差異。所以初步選定發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精生成的影響結(jié)果

發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酒精也有一定影響[18]，前發(fā)酵期發(fā)酵作用不強(qiáng)，主發(fā)酵期主要進(jìn)行酒精發(fā)酵作用，糖分迅速下降，酒精逐漸增多。后發(fā)酵期由于大部分糖分被消耗，產(chǎn)生酒精較少。

圖2 表明，在發(fā)酵時(shí)間從4～5 d 時(shí)，酒精度上升明顯，之后隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。方差分析結(jié)果顯示，發(fā)酵時(shí)間3、4 d 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和發(fā)酵時(shí)間5、6、7 d 三個(gè)實(shí)驗(yàn)組在95%水平下差異顯著。發(fā)酵時(shí)間初步選為5 d。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度的影響Fig.2 Effect of fermentation time on alcohol content

2.3 磷酸氫二銨添加量對(duì)酒精生成的影響結(jié)果

發(fā)酵液中氮源過(guò)多會(huì)造成酵母菌生長(zhǎng)過(guò)快，反而不利于產(chǎn)物的積累。氮源不足又會(huì)使菌體生長(zhǎng)緩慢，在穩(wěn)定期引起菌體自溶。因此合理控制氮源的添加量能促進(jìn)菌體穩(wěn)定生長(zhǎng)以及產(chǎn)物的積累[19]。圖3 表明，磷酸氫二銨濃度的變化對(duì)酒精度影響不明顯。方差分析結(jié)果顯示，五個(gè)實(shí)驗(yàn)組無(wú)顯著性差異。說(shuō)明在這個(gè)范圍內(nèi)磷酸氫二銨的濃度對(duì)蜂蜜發(fā)酵液酒精度影響不大。所以磷酸氫二銨濃度初步選為900 mg/L。

圖3 磷酸氫二銨添加量對(duì)酒精度的影響Fig.3 Effect of diammonium phosphate on alcohol content

2.4 發(fā)酵液糖度對(duì)酒精生成的影響的結(jié)果

當(dāng)發(fā)酵液中糖度過(guò)高時(shí)，不僅會(huì)抑制乙醇產(chǎn)生途徑中乙醇脫氫酶的活性而影響發(fā)酵，而且也不利于酒精產(chǎn)物的積累，同時(shí)會(huì)造成高滲透壓環(huán)境而抑制酵母的生長(zhǎng)。發(fā)酵液糖度過(guò)低又會(huì)減緩酵母生長(zhǎng)，并且糖分幾乎全為酵母生長(zhǎng)所用，導(dǎo)致發(fā)酵不能正常進(jìn)行[20]。

圖4 表明，酒精度隨著發(fā)酵液糖度升高而上升，當(dāng)發(fā)酵液糖度從20.0%～28.0%時(shí)，酒精度上升的趨勢(shì)明顯。通過(guò)方差分析得知，糖度16.0%、20.0%、24.0%、28.0%四個(gè)實(shí)驗(yàn)組在95%水平下差異顯著，糖度28.0%和32.0%兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組無(wú)顯著性差異。初步選定發(fā)酵液糖度為28.0%。

圖4 發(fā)酵液糖度對(duì)酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation liquid sugar on alcohol content

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果

2.5.1 酒精度回歸模型的建立和顯著性檢驗(yàn)

由響應(yīng)面分析得到17 組實(shí)驗(yàn)條件，每組做次平行實(shí)驗(yàn)后得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表。

經(jīng)響應(yīng)面軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到回歸方程：

由表3 知，模型的P值<0.00 1，說(shuō)明了模型的極顯著性?；貧w方程方程相關(guān)系數(shù)R2=0.976>0.9，表明約有97.6%的酒精度變化可由此模型解釋。對(duì)糖度、溫度、時(shí)間分別進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)溫度P<0.05，時(shí)間P<0.00 1，說(shuō)明溫度和時(shí)間對(duì)酒精度的影響分別是顯著和極顯著的。而糖度P值為0.558 7>0.05，說(shuō)明糖度對(duì)酒精度影響不顯著。在二次項(xiàng)中，糖度P<0.01、溫度P<0.01、時(shí)間P<0.01，說(shuō)明提取糖度、溫度和時(shí)間對(duì)酒精度的影響都是高度顯著的。交互項(xiàng)中AC<0.01，BC<0.01，差異高度顯著。綜上所述，回歸方程給酒精度提供了一個(gè)合適的模型。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis results of regression equation variance

2.5.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

響應(yīng)面的曲面形狀可作為其影響因素顯著水平的依據(jù)，曲面的陡峭程度用以表明其顯著性，曲面越陡說(shuō)明越顯著。由圖5 可看出，相對(duì)于溫度和糖度，發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度影響較為顯著。

圖5 發(fā)酵時(shí)間、溫度、糖度及交互作用對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵酒精度影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of fermentation time, temperature, sugar content and interaction on the fermentation alcohol degree of honey wine

響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)酵液初始糖度為31.0%，發(fā)酵溫度為31.6 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為6 d的時(shí)候能夠得到酒精度的理論最大值為13.8%。

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證該模型給出的方案是否與實(shí)際情況相符合，進(jìn)行兩次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。出于實(shí)際情況的考慮，將理論最優(yōu)條件圓整為發(fā)酵液初始糖度為31.0%，發(fā)酵溫度為32.0 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為6 d。由此得到發(fā)酵液酒精度為13.2%，實(shí)際測(cè)定值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為4.3%，說(shuō)明響應(yīng)面模型能較好的反應(yīng)實(shí)際情況。在響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)第17 組中，當(dāng)發(fā)酵液糖度為32.0%，發(fā)酵溫度為32.0 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為 6 d 時(shí)，得到的發(fā)酵液酒精度為13.6%，大于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以，該條件作為最佳條件。該結(jié)果與理論的優(yōu)化結(jié)果存在一定的差距，可能是實(shí)驗(yàn)的條件控制等方面的誤差所導(dǎo)致。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，考察了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、磷酸氫二銨添加量、發(fā)酵液糖度等因素對(duì)酒精度的影響。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得出酒精度的優(yōu)化結(jié)果為：當(dāng)麥曲添加量10.0 g，酵母添加量0.5 g，磷酸氫二銨添加量150 mg，發(fā)酵液糖度為32.0%，pH 值為4.5，發(fā)酵溫度為32.0 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為 6 d 時(shí)，能得到酒精度的最高值為13.6%。同時(shí)，經(jīng)過(guò)初步感官評(píng)價(jià)，麥曲和酵母共同發(fā)酵的蜂蜜酒的風(fēng)味明顯優(yōu)于單獨(dú)用酵母發(fā)酵的蜂蜜酒。