李娟妮，徐志杰，胡寬

（中南大學湘雅醫(yī)院1.病理科2.肝臟外科，湖南長沙410008）

胃癌是是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。而我國又是胃癌高發(fā)區(qū)，患者數(shù)約占全球40%，由于現(xiàn)在生活節(jié)奏、飲食習慣的改變，胃癌的發(fā)病率呈逐年攀升趨勢，其中年輕人的占比也逐漸升高[2]。目前針對胃癌的治療已進入分子時代，基因測序、分子靶向及免疫治療的進展使得胃癌的治療日益精準化[3]。因此，發(fā)現(xiàn)新型胃癌特異性生物標志物及治療靶點一直是胃癌相關研究的熱點方向。

Gasdermin（GSDM）家族成員是近來鑒定的成孔效應蛋白。在人類中，GSDM 家族內(nèi)成員基于同源性鑒定共有6 個，分別是GSDMA、GSDMB、GSDMC、 GSDMD、 DFNA5 （GSDME） 和 PJVK（DFNB59）。GSDM 家族成員在晶體結(jié)構(gòu)中共享一個高度類似的成孔結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是GSDM 蛋白發(fā)揮功能的主要結(jié)構(gòu)域，負責介導細胞膜透化和細胞焦亡[4-6]。細胞焦亡是一種GSDM 蛋白介導的具有促炎特征的細胞程序性死亡形式，在生理上對于人體發(fā)育、免疫反應發(fā)揮重要作用[7]。近年來，不斷有研究揭示了焦亡及GSDM 家族分子在多種癌癥類型中存在表達/功能的失調(diào)，為腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的進一步研究提供了新的思路。例如，單核苷酸多態(tài)性變體rs8067378 能顯著增加GSDMB的表達，從而提高宮頸癌的發(fā)生率[8]；GSDMC 在結(jié)直腸癌中是促癌基因，將其敲低將導致結(jié)直腸癌細胞系的增殖能力減弱[9]；GSDMD 在非小細胞肺癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中表達升高，且腫瘤細胞侵襲能力越強，GSDMD 的表達越高[10]。然而，GSDM 家族成員在胃癌中的表達、預后價值、功能和潛在機制研究尚待闡明。

本研究從GSDM 家族這一整體概念出發(fā)，通過多個生物信息平臺數(shù)據(jù)庫，系統(tǒng)分析了GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、DFNA5、PJVK 這6 個家族成員在胃癌中的表達差異、預后價值、基因變異情況、參與腫瘤進程的潛在功能及信號通路、與腫瘤免疫的相關性以及甲基化狀態(tài)，旨在加深研究者對胃癌中GSDM 基因家族的理解，為深入研究胃癌中GSDM 家族各分子提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 表達相關數(shù)據(jù)庫（ONCOMINE、UALCAN 和GEPIA2）分析

ONCOMINE 作為腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)庫，可用于分析基因表達差異、尋找離群值、預測共表達基因等[11]。UALCAN 是基于TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫資源進行腫瘤數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站[12]。通過ONCOMINE 和UALCAN 來比較胃癌和正常組織之間GSDM 家族的mRNA 差異表達。GSDM 家族成員與TNM 分期及腫瘤分級之間的相關性探究由UALCAN完成。GSDM 家族各成員之間的相對表達水平和關聯(lián)分析由GEPIA2 完成[13]。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 生存分析數(shù)據(jù)庫（Kaplan-Meier plotter 和GEPIA2）分析

Kaplan-Meier plotter 和GEPIA2 數(shù)據(jù)庫都可以用于評估某基因與常見癌癥類型的預后關系[14]。本研究使用這兩個數(shù)據(jù)庫進行GSDM 家族在胃癌患者中的生存分析，以總生存期（OS）作為主要研究終點。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 cBioPortal和Cytoscape分析

cBioPortal 是一個癌癥基因組學數(shù)據(jù)庫，包含常見癌癥類型的基因組數(shù)據(jù)，并可供用戶進行下載和分析[15]。通過該數(shù)據(jù)庫獲得胃癌患者數(shù)據(jù)集的基因改變狀況（TCGA，F(xiàn)irehose Legacy，369 例），以此來明確GSDM 家族的基因改變頻率和類型。胃癌中GSDM 家族相關基因的篩選也是通過該數(shù)據(jù)庫，共篩選出186 個GSDM 家族相關基因，并通過Cytoscape 工具繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。

1.4 WebGestalt分析

WebGestalt 全稱為WEB-based Gene SeT AnaLysis Toolkit，是一個基于公共數(shù)據(jù)庫的基因集分析工具[16]。本研究中，將186 個GSDM 家族相關基因?qū)隬ebGestalt 獲得GO 功能和KEGG 通路的富集分析數(shù)據(jù)。

1.5 TIMER 2.0分析

TIMER 2.0 是一個基于TCGA 等公共數(shù)據(jù)庫的綜合分析平臺，提供常見癌癥中基因表達差異和免疫細胞浸潤的相關性分析[17]。通過TIMER 2.0 的“免疫關聯(lián)”模塊進行GSDM 家族基因表達和CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等免疫細胞的相關性分析。

1.6 DiseaseMeth分析

DiseaseMeth 是一個涵蓋多種癌癥類型的研究甲基化異常的數(shù)據(jù)庫[18]。通過該數(shù)據(jù)庫分析GSDM家族各成員在胃癌組織和正常胃組織中的DNA 甲基化水平的差異。

2 結(jié) 果

2.1 GSDM基因家族在胃癌中的表達

通過ONCOMINE 和UALCAN 數(shù)據(jù)庫對GSDM 基因家族在胃癌中的mRNA 表達進行了分析。ONCOMINE 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示：胃癌組織中DFNA5 明顯高表達，其表達水平較正常組織升高2.479 倍（Cho Gastric 數(shù)據(jù)集）；GSDMB 的表達在胃癌組織中明顯降低，較正常組織下降2.042～2.074 倍（Chen Gastric 數(shù)據(jù)集和DErrico Gastric 數(shù)據(jù)集）；其余4 個成員GSDMA、GSDMC、GSDMD 和PJVK 在胃癌中的表達較正常組織無差異（圖1A）。另外，UALCAN 數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示： GSDMA、GSDMB、GSDMD、DFNA5 的表達水平在胃癌中較正常胃組織明顯升高，而GSDMC、PJVK 的表達無明顯差異（圖1B）。上述二個數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示：僅有DFNA5 的表達在兩個數(shù)據(jù)庫中具有一致性，其在胃癌組織中高表達，是潛在的促癌基因。接著，通過GEPIA2 數(shù)據(jù)庫比較胃癌中GSDM 家族各成員之間的相對表達水平，發(fā)現(xiàn)它們的相對表達量從高到低排列依次是GSDMB>GSDMD>DFNA5>PJVK>GSDMA>GSDMC（圖1C）。

圖1 GSDM 基因家族的mRNA 表達情況 A：GSDM 基因家族各成員在胃癌組織和正常組織中的mRNA 表達（ONCO‐MINE）；B：GSDM基因家族各成員在胃癌組織和正常組織中的mRNA表達（UALCAN）；C：胃癌組織中各GSDM家族成員的相對表達水平（GEPIA2）Figure 1 The mRNA expression levels of GSDM family members A: The mRNA expression levels of individual GSDM member in gastric cancer tissues and normal tissues (ONCOMINE); B: The mRNA expression levels of individual GSDM member in gastric cancer tissues and normal tissues(UALCAN);C:Relative mRNA expression levels of each GSDM mem‐ber in gastric cancer tissues(GEPIA2)

接下來，利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫探究GSDM 家族的表達與臨床TNM 分期的相關性，結(jié)果顯示：GSDMA、GSDMB、GSDMD、DFNA5 的mRNA 表 達在多個TNM 分期間存在明顯差異（圖2）。筆者前期結(jié)果顯示：僅有DFNA5 的mRNA 表達在兩個數(shù)據(jù)庫中具有一致性，均在胃癌組織中高表達。于是本研究進一步探究DFNA5 與TNM 分期或腫瘤分級的關系，結(jié)果顯示：DFNA5 在TNM 2、3、4 期的表達水平較TNM 1 期及正常組織明顯升高，提示DFNA5 可能是反映進展期胃癌的有效指標（圖2A）。同時DFNA5 也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤分級密切相關，DFNA5 在腫瘤分級2、3 級中的表達明顯升高，表明DFNA5 與較差的分化程度可能相關（圖2B）。

圖2 GSDM基因家族的表達與胃癌患者臨床分期及腫瘤分級的關系（UALCAN） A：GSDM基因家族各成員與臨床分期的關系；B：DFNA5的表達與腫瘤分級的關系Figure 2 The relationship between the mRNA expression of GSDM family members and clinical cancer stage in patients with gastric cancer(UALCAN) A:The relationship between individual GSDM member and clinical cancer stage;B:The re‐lationship between DFNA5 expression and tumor grade

2.2 GSDM基因家族在胃癌患者中的預后價值

本研究中，采用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫評估GSDM 家族在胃癌中的預后價值，分析結(jié)果顯示：高表達GSDMC（P=0.028）和DFNA5（P=0.0013）的胃癌患者具有更差的總OS，而高表達GSDMD（P=0.007）的胃癌患者具有更好的OS（圖3）。綜合上述GSDM 家族成員在胃癌中的表達趨勢及與患者預后關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：只有DFNA5 在胃癌中的表達趨勢和預后關系相一致，即DFNA5 在胃癌中高表達，并與患者的更差預后相關，提示DFNA5 可能是胃癌患者潛在的預后標志物和治療靶點。

圖3 GSDM基因家族的表達與胃癌患者OS的相關性（Kaplan-Meier plotter）Figure 3 The relationship between the mRNA expression of GSDM family members and OS in patients with gastric cancer(Kaplan-Meier plotter)

2.3 GSDM基因家族在胃癌中的基因改變狀況

通過cBioPortal 數(shù)據(jù)庫分析胃癌患者數(shù)據(jù)集的基因改變狀況（TCGA, Firehose Legacy，369 例），結(jié)果顯示：在369 例胃癌患者中，共有167 例（45%）患者存在GSDM 家族基因改變，其中基因變異率GSDMD最高（19%），GSDMA、GSDMB、GSDMC 次之（14%），DFNA5 （8%） 和PJVK 最低（6%）（圖4A）。此外，通過GEPIA2 數(shù)據(jù)庫對GSDM 家族分子之間的相關性進行分析并繪制成熱圖，結(jié)果顯示： GSDMB 和GSDMD， GSDMA 和GSDMB 之間明顯正相關，而GSDMD 與PJVK 間明顯負相關（圖4B）。

圖4 GSDM基因家族的基因改變及各成員之間的相關性 A：GSDM基因家族各成員的基因改變頻率（cBioPortal；TCGA，F(xiàn)irehose Legacy）；B：GSDM家族各成員之間的相關性分析（GEPIA2）Figure 4 The genetic alteration of individual GSDM family member and the correlation among its members A:The genetic alteration frequency of each GSDM member(cBioPortal;TCGA,Firehose Legacy);B:Correlation analysis among the GS‐DM family members(GEPIA2)

2.4 GSDM基因家族相關共表達基因的功能及通路富集分析

進一步探究GSDM 基因家族相關共表達基因的作用，有助于更好地了解GSDM 基因家族的功能。通過cBioPortal 中的胃癌患者數(shù)據(jù)集（TCGA，F(xiàn)irehose Legacy）獲得369 例胃癌患者信息，并篩選出186 個GSDM 相關的共表達基因，并根據(jù)它們之間的共表達關系使用Cytoscape 工具繪制成蛋白相互作用網(wǎng)絡圖發(fā)現(xiàn)： CXCL8、 CXCL1、 PF4、PPARG 是GSDM 基因家族功能最密切相關的主要分子（圖5A）。接著，通過WebGestalt 數(shù)據(jù)庫的GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析，進一步探討GSDM 相關分子的生物學功能，結(jié)果顯示：GSDM基因家族相關分子主要富集分布于細胞膜、囊泡、細胞核、內(nèi)膜系統(tǒng)中，主要負責生物調(diào)節(jié)和代謝調(diào)控等生物學過程，分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合以及轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)節(jié)等（圖5B）；KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示：GSDM 基因家族相關分子在胃癌中的差異表達主要涉及炎癥細胞凋亡、趨化因子反應、急性炎癥反應相關的信號通路（圖5C）。

圖5 GSDM 基因家族相關共表達基因的功能分析 A：蛋白相互作用圖展示胃癌中與GSDM 基因家族共表達的186 個基因（cBioPortal，Cytoscape）；B：GO功能富集分析預測與GSDM基因家族共表達分子相關的生物過程、細胞成分、分子功能（WebGestalt）；C：KEGG通路富集分析GSDM基因家族共表達分子主要涉及的相關信號通路（WebGestalt）Figure 5 Functional analysis of related co-expressed genes of GSDM family members A:The protein-protein interaction dia‐gram showing 186 genes co-expressed with the GSDM family members in gastric cancer (cBioPortal, Cytoscape); B: GO functional enrichment analysis predicting the biological processes, cellular components and molecular functions related to the GSDM family co-expression molecules (WebGestalt); C: KEGG pathway enrichment analysis predicting the main sig‐nal pathways related to the GSDM family co-expression molecules(WebGestalt)

2.5 GSDM基因家族與胃癌免疫細胞浸潤的相關性

胃癌組織周圍的免疫細胞浸潤是重要的腫瘤微環(huán)境組成部分。本研究為了進一步探討GSDM 基因家族成員是否參與免疫相關調(diào)節(jié)機制，通過TIMER 2.0 數(shù)據(jù)庫分析GSDM 基因家族各成員與CD8+T 細胞、CD4+T 細胞、B 細胞、樹突細胞、巨噬細胞、中性粒細胞浸潤的相關性，結(jié)果顯示：GSDMA、GSDMC、GSDMD、DFNA5 與CD8+T 細胞浸潤呈正相關；GSDMA、PJVK 與CD4+T 細胞浸潤呈正相關；GSDMB、GSDMD 與B 細胞浸潤呈正相關；GSDMA、GSDMC、DFNA5 與中性粒細胞浸潤呈正相關；GSDMA、GSDMD、DFNA5 與巨噬細胞浸潤呈正相關，而PJVK 與之呈負相關；GSDMA、GSDMC、GSDMD、DFNA5 與樹突細胞浸潤呈正相關，而PJVK 與之呈負相關（圖6）。

2.6 GSDM基因家族在胃癌中的甲基化

DNA 甲基化是常見的癌癥相關基因調(diào)控途徑。本研究通過DiseaseMeth 數(shù)據(jù)庫分析胃癌中GSDM 基因家族各成員的表達與其DNA 甲基化水平的關系，結(jié)果顯示：GSDMA、GSDMC、GSDMD 在胃癌中的甲基化水平較正常胃組織中顯著降低。結(jié)合前期研究結(jié)果：GSDMA、GSDMD 的mRNA 水平在胃癌中 顯 著 高 表 達（UALCAN）， 提 示： GSDMA、GSDMD 在胃癌組織中的異常高表達的調(diào)控機制可能與它們的低甲基化水平有關。DFNA5 在胃癌組織中高表達， 但其甲基化水平無明顯改變（圖7）。

圖7 GSDM基因家族各成員在胃癌組織和正常胃組織中的DNA甲基化水平分析（DiseaseMeth）Figure 7 DNA methylation levels of individual GSDM family members between gastric cancer tissues and normal tissues(Dis‐easeMeth)

3 討 論

焦亡作為一種促炎性程序性細胞死亡，主要由GSDM 家族成員介導，發(fā)生過程中伴有多種炎癥和免疫反應[19-20]。近年來的研究表明，GSDM 家族的表達失調(diào)與多種癌癥生物學行為相關，是非常有前景的研究新方向。以GSDMC 為例，Watabe等[21]發(fā)現(xiàn)GSDMC 過表達可以促進B16 黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，研究者發(fā)現(xiàn)GSDMC 通過抑制TGFBR2 的活性來增強結(jié)直腸癌細胞的增殖能力從而促進腫瘤發(fā)生[9]。在胃癌中，有文獻[22]報道GSDMC 可以作為抑癌基因明顯抑制胃癌細胞的生長。以上報道說明GSDMC 在不同癌癥中的作用具有異質(zhì)性，甚至可以是截然相反的。

目前尚未有關于GSDM 家族在胃癌中的整體系統(tǒng)性研究。本研究首先通過多個數(shù)據(jù)庫探討了GSDM 家族成員在胃癌組織與正常胃組織中的表達差異。雖然GSDMA、GSDMB、GSDMD、DFNA5 在單個數(shù)據(jù)庫（UALCAN）中顯示出表達的差異性，但僅有DFNA5 的表達模式在多個數(shù)據(jù)庫中具有一致性，即在胃癌組織中高表達，這表明DFNA5 是較為合適的潛在的促癌基因，值得研究者進行深入探索。GSDM 家族成員在Oncomine 及UALCAN 數(shù)據(jù)庫中表達不一致的原因，一方面可能是因為UALCAN 數(shù)據(jù)庫主要收納的是TCGA level 3 級的RNA 測序數(shù)據(jù)，而Oncomine 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)來源主要為已經(jīng)發(fā)表的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)；另一方面，當來自不同數(shù)據(jù)庫的結(jié)果不一致時，提示可能有多重復雜的深層機制導致矛盾結(jié)果的產(chǎn)生，或者是樣本量不足或者是高度異質(zhì)性導致的偏倚。而其他GSDM 基因家族成員在消除偏倚、細化胃癌研究對象標準后也可能具有重要的研究意義。

隨后，生存分析結(jié)果顯示：GSDMC 和DFNA5高表達提示更差的患者預后，而GSDMD 高表達提示更好的預后。同樣，只有DFNA5 在兩個數(shù)據(jù)庫中的生存分析結(jié)果是一致的，且其表達趨勢與預后作用相符合，這進一步證明了DFNA5 作為胃癌促癌基因的可能性。值得注意的是：DFNA5 在某些其他類型腫瘤中被認為是腫瘤抑制基因。例如，在乳腺癌中，DFNA5 通過介導腫瘤細胞的焦亡而發(fā)揮腫瘤抑制作用[23]。在肺癌細胞中，KRAS、EGFR 等小分子抑制劑能通過DFNA5 發(fā)揮抗腫瘤效果[24]。綜上所述，通過進一步的實驗證明和機制探索，DFNA5 很可能作為新的腫瘤標志物和治療靶點改善胃癌患者的診治與生存。

本研究篩選了胃癌中與GSDM 基因家族功能相關的差異表達分子，并進行了功能和通路富集分析，以期望能促進研究者們對GSDM 家族與胃癌之間關系的理解。GSDM 基因家族相關分子主要涉及炎癥細胞凋亡、趨化因子反應、急性炎癥反應相關的信號通路，這與病原體衍生或宿主衍生的危險信號介導caspase 切割GSDM 家族蛋白，從而同時發(fā)揮焦亡及凋亡功能的理論相一致。GSDM 基因家族可以通過觸發(fā)細胞焦亡來抑制腫瘤生長，具體機制被認為與免疫相關，即細胞焦亡通過增強腫瘤相關巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬作用，以及影響腫瘤浸潤性CD8+T 細胞的數(shù)量和功能來激活抗腫瘤免疫[25]。本研究揭示了胃癌中GSDM 基因家族各分子的表達與多種免疫細胞浸潤的關系，發(fā)現(xiàn)多數(shù)GSDM 家族成員的表達與CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、B 細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞的浸潤存在不同程度的顯著正相關，僅PJVK 在巨噬細胞和樹突細胞浸潤中呈負相關，說明胃癌中GSDM 家族的免疫細胞浸潤譜存在特征性，并在一定程度上與GSDM 家族的焦亡機制密切相關，有作為新的生物標志物和免疫治療療效評估標志物的潛力。

DNA 甲基化是經(jīng)典的表觀遺傳學修飾過程，在調(diào)節(jié)多種人類癌癥相關基因的表達方面發(fā)揮關鍵作用[26]。Upchurch 等[27]發(fā)現(xiàn)異常的啟動子低甲基化狀態(tài)會顯著影響血液系統(tǒng)惡性腫瘤中多種癌基因的表達水平； 磷酸核糖氨基咪唑羧化酶（PAICS）的啟動子區(qū)域在肺癌中經(jīng)常處于低甲基化狀態(tài)，這導致了PAICS 的激活從而發(fā)揮腫瘤啟動子的作用[28]。DFNA5 是caspase-3 介導的細胞焦亡的執(zhí)行者，它在胃癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌中通過甲基化在表觀遺傳上沉默，從而發(fā)揮腫瘤抑制因子的功能[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，GSDMA、GSDMD 在胃癌組織中的異常高表達的調(diào)控機制可能與它們的低甲基化水平有關。另外，胃癌中DFNA5 的甲基化水平無明顯改變，這與已有的文獻存在不相符之處，可能是由于樣本量不足的原因，或者是納入的患者存在偏倚因素，需經(jīng)過更多和更大樣本量的研究進行驗證。

本研究有以下幾點局限性。首先，本研究用于分析的數(shù)據(jù)來自多個在線數(shù)據(jù)庫，需要進一步的體內(nèi)及體外來驗證。此外，對單個GSDM 成員在胃癌中的具體機制缺乏了解，后續(xù)的研究工作將通過具體實驗進一步探究GSDM 各成員在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。