張路遙，張潔瑋，李夢迪，楚玉柔，施澤軒，韓 梅

(上海商學院酒店管理學院，上海 200235)

水果和蔬菜被認為是理想的益生菌天然培養(yǎng)基，不僅感官上很受歡迎，還含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如礦物質(zhì)、維生素、膳食纖維和抗氧化物質(zhì)等[1]。在經(jīng)過益生菌發(fā)酵后，會有一些風味、色澤、營養(yǎng)成分等品質(zhì)的變化，賦予產(chǎn)品新的發(fā)酵風味[2-5]，如降低產(chǎn)品的pH而使一些如花青素等在酸性環(huán)境較穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)能夠更好地保存[6-8]，提高產(chǎn)品貯藏性的同時，增加了其營養(yǎng)價值。簡而言之，益生菌能夠利用水果和蔬菜中豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素等，將這些營養(yǎng)成分代謝轉換為小分子活性物質(zhì)，如氨基酸、酶類、有機酸等。這樣不僅保留了天然果香，還增加了營養(yǎng)密度[9]。

發(fā)酵果蔬汁飲料豐富了果蔬制品的營養(yǎng)性及功能性，與當代人們的綠色、天然、健康和營養(yǎng)飲食消費習慣相吻合，而復合型果蔬汁更符合消費者的喜好和現(xiàn)代飲料的發(fā)展趨勢[10-11]，具有廣闊的市場前景。美國、德國、日本等國家已經(jīng)研發(fā)了一些發(fā)酵果蔬飲料，如日本的一種新型發(fā)酵蔬菜飲料——“蔬菜戰(zhàn)士”，頗受市場歡迎[12]。近年來，國內(nèi)的研究人員一直在嘗試利用益生菌發(fā)酵果蔬汁。眾多研究者通過氨基酸分析儀、GC-MS等方法分析各果蔬汁發(fā)酵前后揮發(fā)性風味物質(zhì)、氨基酸和糖等成分的變化，探討了乳酸菌發(fā)酵對果蔬汁感官品質(zhì)及適配性問題的影響，如使用植物乳桿菌發(fā)酵單一的果蔬汁（橙汁、青瓜汁、蘋果汁、葡萄汁和梨汁），發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵代謝對不同果蔬汁風味影響差異較大[13-14]，植物乳桿菌發(fā)酵胡蘿卜原漿后提升了質(zhì)構和抑菌性[15-16]，還可以提升鐵的溶解性[6]，石榴汁中使用乳酪桿菌和植物乳桿菌單一菌株發(fā)酵后品質(zhì)提升[17]。

近年來多數(shù)研究是利用酸奶中常用的益生菌對單一果蔬汁進行發(fā)酵工藝的優(yōu)化，但對復合果蔬汁的不同菌種發(fā)酵工藝的研究較少[14]。鑒于此，作者采用單因素試驗對發(fā)酵復合果蔬汁的發(fā)酵時間、果蔬種類、發(fā)酵菌種進行研究，優(yōu)化最適的果蔬種類、菌種及發(fā)酵工藝參數(shù)，探討影響發(fā)酵果蔬汁風味物質(zhì)的變化規(guī)律，以期為提高果蔬汁的營養(yǎng)價值、滿足消費者的需求以及解決果蔬利用率等問題提供思路，同時期望能為生產(chǎn)高品質(zhì)的益生菌發(fā)酵果蔬汁、開發(fā)更多發(fā)酵制品的研究提供較為系統(tǒng)研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 臍橙、水晶梨、蘋果、黃瓜、芒果、圣女果、胡蘿卜和紫甘藍，市售；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum, Vege-Start2.0 CN )和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaseiL. casei 431），丹麥科漢森公司；SY 葡萄酒·果酒專用酵母，安琪酵母股份有限公司；馬克思克魯維酵母菌和瑞士乳桿菌，上海商學院實驗室；MRS 固體培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器與設備 LDZX-50FBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機械廠；GXM-0258A 智能光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；AL204 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；B79 多功能高速破壁料理機，上海恒聯(lián)廚具有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；FG2便攜式pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PAL-1 手持折光儀，日本愛拓公司；XW-80A 微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；GC2010-QP2010 Ultra氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 果蔬汁前處理 將臍橙、芒果洗凈并去皮，蘋果、水晶梨、胡蘿卜、圣女果、紫甘藍、黃瓜洗凈，取可食用的果肉，全部切成小塊，隨后用榨汁機分別榨汁，按2:1的料液比加水、過濾，獲得澄清果蔬汁。每200 mL分裝于容量為250 mL的潔凈滅菌玻璃瓶中，密封。

1.2.2 接種前滅菌 用水浴鍋將果蔬汁加熱至90 ℃，保持10 min，然后冷卻至室溫，準備接種。

1.2.3 接種與發(fā)酵 植物乳桿菌與副干酪乳桿菌的接種量為每100 g果蔬汁接種0.004 g菌粉。果酒酵母和馬克思克魯維酵母菌的接種量為0.04%，瑞士乳桿菌接種1%的菌液1 mL。若兩個菌種復合發(fā)酵則各加一半的接種量。接種前先量取20 mL蒸餾水于離心管中，滅菌后將計算好的相應質(zhì)量的菌粉加入離心管中活化，再用移液槍取1 mL置于果蔬汁中，搖晃均勻。將接種完的果蔬汁放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵。

1.2.4 糖酸調(diào)配 根據(jù)發(fā)酵后果蔬汁的滴定酸度，計算調(diào)配出6%的含糖量、60 °T左右滴定酸度最終成品所需的糖水添加量，使果蔬汁稀釋到合適的酸甜比例，擁有更好的風味。

1.2.5 指標測定 活菌數(shù)：參考GB 4789.35—2016，采用稀釋平板計數(shù)法進行測定；pH：參考GB 5009.237—2016；糖度：參照GB/T 12143-2008中折光計法；滴定酸度：參考GB 5009.239—2016 酚酞指示劑法中發(fā)酵乳的測定方法。由于果蔬汁顏色豐富，無法觀察到酚酞指示劑的顏色變化，修改滴定終點為pH 7.0。

1.2.6 感官評價 感官評價小組由20名經(jīng)過培訓的食品專業(yè)人員組成，對樣品的氣味、口味和表觀、總體接受度進行評分。最終各樣品的感官評分取感官評價小組的平均分，評分標準見表1。

表1 發(fā)酵果蔬汁的感官評分標準Table 1 Sensory evaluation of the fermented fruit and vegetable juice

1.2.7 揮發(fā)性風味物質(zhì)的GC-MS測定 樣品前處理方法：采用水——有機溶劑混合萃取法，稱取4 g樣品；連接水蒸氣蒸餾裝置，量取50 mL水和50 mL正己烷于蒸餾瓶中，在恒溫水浴鍋內(nèi)80 ℃蒸餾30 min，待不再有餾液出現(xiàn)時，停止蒸餾；取上層液加入無水硫酸銅粉末，震蕩后靜止5 min后，過 0.45 μm 有機相濾膜于進樣瓶中。

GC-MS條件根據(jù)李汴生等[14]的方法略作修改。色譜條件：載氣為He氣（純度 ≥ 99.999%），流速1.93 mL·min-1。進樣口溫度為250 ℃，進樣方式為不分流進樣。升溫程序條件是起始溫度為40 ℃，保持3 min 后以4 ℃·min-1的速度升溫至120 ℃，再以6 ℃·min-1的速度升溫至240 ℃，保持9 min。質(zhì)譜條件：采用電子轟擊電離，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，接口溫度為230 ℃，質(zhì)量掃描范圍為質(zhì)荷比35～500。

1.2.8 圖表繪制及數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)需要重復測定3次，采用SPSS 22.0來處理和分析數(shù)據(jù)，應用Origin Pro 9.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 菌種對發(fā)酵的影響

以臍橙、水晶梨、蘋果、黃瓜、胡蘿卜、圣女果和紫甘藍混合的復合果蔬汁為原料，分別接種適量的植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌和果酒酵母，測定發(fā)酵過程中的pH、滴定酸度和糖度隨發(fā)酵時間的變化。結果（圖1）顯示，除果酒酵母外，不同乳酸菌發(fā)酵后的pH、滴定酸度和糖度差異不明顯，但發(fā)酵過程中產(chǎn)酸、糖分解速率各不相同，果酒酵母與其他菌發(fā)酵后各項指標有明顯的區(qū)別，其發(fā)酵后糖度大量減少，最后酸度最低。各菌種發(fā)酵的果蔬汁在發(fā)酵了48 h后，各指標變化速率降低。各乳酸菌中植物乳桿菌產(chǎn)酸最快，其次是副干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌，選用此3種菌作為復配菌種進行發(fā)酵，其發(fā)酵后的pH和滴定酸度變化較快，發(fā)酵后活菌數(shù)lg CFU顯著高于副干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌，而與植物乳桿菌無顯著差異。

圖1 菌種對混合果蔬汁發(fā)酵結果的影響Figure 1 Effects of strains on fermentation results of the mixed fruit and vegetable juice

由于過酸會導致果蔬汁的風味不佳[14]，營養(yǎng)物質(zhì)減少，從而導致活菌數(shù)下降，酸度一般控制在60至70 ° T為宜，而各乳酸菌種發(fā)酵的復合果蔬汁在發(fā)酵了48 h后酸度適中，由此采用植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌復配發(fā)酵48 h為宜。

2.2 果蔬種類對發(fā)酵結果的影響

將臍橙、水晶梨、蘋果、黃瓜、芒果、圣女果、胡蘿卜和紫甘藍榨汁、過濾后，分別接種植物乳桿菌進行發(fā)酵，測定其初始、發(fā)酵24和48 h的pH值、滴定酸度和糖度。結果（圖2）表明，產(chǎn)酸較多的果蔬種類為胡蘿卜、圣女果、紫甘藍、橙子和芒果，而發(fā)酵后活菌數(shù)結果顯示蘋果汁、梨汁、黃瓜汁、橙汁和紫甘藍的活菌數(shù)9.0 lg（CFU·mL-1）低于其他幾種發(fā)酵果蔬汁的活菌數(shù)低9.5 lg（CFU·mL-1）。因此，綜合風味和活菌數(shù)含量，最終選取芒果、圣女果和胡蘿卜作為果蔬汁的復合配方。

圖2 果蔬種類對發(fā)酵產(chǎn)品的影響Figure 2 Effects of fruit and vegetable species on fermentation products

2.3 感官評價結果

用植物乳桿菌單菌種發(fā)酵芒果汁、圣女果汁、胡蘿卜汁及它們的復合果汁，并應用混合菌種發(fā)酵胡蘿卜汁，分別得到發(fā)酵芒果汁、發(fā)酵圣女果汁、發(fā)酵胡蘿卜汁、胡蘿卜復菌及發(fā)酵復合果蔬汁5種樣品，并進行糖蒜調(diào)配后，進行感官評價，結果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵果蔬汁的感官評價結果Figure 3 Sensory evaluation of the fermented juices

圖3顯示，發(fā)酵果蔬汁經(jīng)過糖酸調(diào)配后感官評價結果明顯提高，果蔬汁具有明顯的發(fā)酵風味，由于調(diào)味前過多的酸度會影響果蔬汁的總體風味[14]，調(diào)配后果蔬汁呈現(xiàn)更好的感官接受度，與調(diào)配前的發(fā)酵果蔬汁相比，發(fā)酵果蔬汁在外觀、香氣的感官評價得分上變化不明顯，而在酸度、滋味和接受程度上，有明顯的改善；合適的酸甜比使得發(fā)酵果蔬汁的果蔬風味和發(fā)酵風味產(chǎn)生相乘作用，極大地提高了發(fā)酵胡蘿卜汁和發(fā)酵圣女果汁的感官接受度，復合果蔬汁也得到一定提高；發(fā)酵復合果蔬汁與發(fā)酵芒果汁、圣女果汁和胡蘿卜汁相比具有更好的感官接受度。

2.4 GC-MS風味成分分析

通過氣質(zhì)色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對各個發(fā)酵24 和48 h及調(diào)配后的單一果蔬汁和發(fā)酵復合果蔬汁進行揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定，具體見表2。

表2 不同發(fā)酵果蔬汁的風味物質(zhì)Table 2 Changes of the main volatile compounds in different juices after fermentation

由表2可知，GC-MS檢測出混合果蔬汁固有的風味物質(zhì)主要為萜烯類、少量酯類和酸類，在混合菌種發(fā)酵24 h后揮發(fā)性風味成分數(shù)量增多，酯類風味含量有較大增加，其次為酸類、醇類，且發(fā)酵48 h后有進一步的增加；這種變化是果蔬汁在乳酸菌的代謝導致的，酸類增加，并與醇酯化成酯類風味；醇類、酯類和酸類的揮發(fā)性風味物質(zhì)賦予了混合果蔬汁濃郁的水果香味；混合果蔬汁在混合菌種的發(fā)酵48 h后風味更豐富，風味特性更加飽滿，因此最適發(fā)酵時間為48 h。

3 結論

開發(fā)高品質(zhì)的益生菌發(fā)酵復合果蔬汁，得到的最佳工藝為選擇芒果、圣女果和胡蘿卜為符合果蔬汁原料，以植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌復配發(fā)酵48 h的制品pH低，酸度較高，活菌數(shù)高，感官評價結果質(zhì)量最優(yōu)；GC-MS風味分析表明，發(fā)酵過程中酯類、醇類和酸類的揮發(fā)性風味物質(zhì)相對增加，風味較好。