姜峰，晏子玉，樂治平，2

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西 南昌330031;2.貴州荔波億隆之家農(nóng)業(yè)科技有限公司，貴州 荔波 558400)

自由基和活性氧是造成人體氧化損傷的主要原因，致使脂質(zhì)過氧化以及細(xì)胞中的蛋白質(zhì)變性，由此加速細(xì)胞衰老并誘發(fā)一系列常見的慢性疾病[1]。隨著年齡增長和外界環(huán)境的影響，人體內(nèi)防御系統(tǒng)不足以應(yīng)對自由基和活性氧造成的氧化應(yīng)激，因此需要攝入一定的抗氧化劑來維持體內(nèi)的氧化還原平衡，這就引起了人們對天然抗氧化性食品的極大關(guān)注[2]。

青梅為薔薇科喬木植物梅的一種，含有豐富的維生素、多種有機(jī)酸以及黃酮和多酚等營養(yǎng)物質(zhì)。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，青梅中含有的多酚類物質(zhì)使青梅具有良好的抗氧化能力，且二者間存在顯著的線性相關(guān)性。國外學(xué)者的研究[4]也表明，多酚類物質(zhì)是梅子具有抗氧化性的主要貢獻(xiàn)者，除此之外，類黃酮對自由基的清除作用也起了顯著作用。

食用酵素主要以新鮮水果和蔬菜為原料進(jìn)行發(fā)酵，通過酵母菌等微生物自身的新陳代謝活動而制得，在很大程度上保留了果蔬中的營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分，具有較好的抗氧化作用。劉濤等[5]以桑葚為原料發(fā)酵制得的酵素具有明顯的抗氧化能力。董銀卯等[6]研究了火龍果酵素的抗氧化性能，結(jié)果表明火龍果酵素對超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有很強(qiáng)的清除作用。

本文以新鮮青梅為原料，經(jīng)發(fā)酵制得酵素，研究了青梅酵素在發(fā)酵過程中黃酮和總酚類物質(zhì)成分的變化及其與抗氧化活性的相關(guān)性，為制取青梅酵素產(chǎn)品提供一定的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

新鮮青梅，購于大理市下關(guān)鎮(zhèn)向陽村；白砂糖，市售；蕓香葉苷，分析對照品；沒食子酸，分析對照品；福林酚試劑，生物技術(shù)級；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)；2,2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)；鄰苯三酚、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、濃鹽酸、過硫酸鉀、磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氯乙酸、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-3541高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；UV-5500PC紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司)；雷磁PHS-25型pH計。

1.3 實驗方法

1.3.1 青梅酵素的制備

取新鮮青梅490 g，清洗干凈晾干后按1:1的比例加入適量白砂糖，放于已殺菌處理的密封罐中室溫避光發(fā)酵。發(fā)酵過程中每隔6 d取發(fā)酵酵素液，4 000 r·min-1離心10 min后放于冰箱保存，用于測定。

1.3.2 黃酮質(zhì)量濃度的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定[7]。取適量發(fā)酵不同時間的酵素原液于帶塞比色管中，加入5%NaNO20.5 mL，6 min后加入10%Al(NO3)30.5 mL，6 min后加入4%NaOH 5 mL，用蒸餾水補(bǔ)齊至10 mL，搖勻后靜置15 min，于510 nm處測定吸光度值，以蒸餾水代替樣品作為參比溶液。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=12.054x-0.002 4、R2=0.999 4，計算黃酮質(zhì)量濃度，其中y為吸光度值，x為樣品質(zhì)量濃度，mg·mL-1。

1.3.3 總酚質(zhì)量濃度的測定

采用Folin-Ciocalteu法測定。取適量的發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。取1 mL稀釋過的樣品液于10 mL帶塞比色管中，加入0.25 mol·L-1福林酚試劑1 mL，5 min后加入20%碳酸鈉2 mL，用蒸餾水補(bǔ)齊至刻度線，于760 nm處測定吸光度值，以蒸餾水代替樣品作為參比溶液。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=0.103 4x+0.009 5、R2=0.999 1，計算總酚質(zhì)量濃度，其中y為吸光度值，x為樣品質(zhì)量濃度，μg·mL-1。

1.3.4 羥基自由基清除能力的測定

分別取0.15 mL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在每支試管中分別依次加入9 mmol·L-1FeSO41 mL、9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1 mL和0.03% H2O21 mL，最后加入稀釋過的樣品液1 mL，用蒸餾水補(bǔ)齊至10 mL，搖勻后置于37 ℃水浴中反應(yīng)15 min，于530 nm處測定吸光度值為A2，以蒸餾水代替樣品作為空白組A1，以不加過氧化氫的為參比溶液，羥基自由基清除率用X1表示，計算公式如下：

ρ(蘆丁)/(mg·mL-1)

ρ(沒食了酸)/(μg·mL-1)

1.3.5 超氧陰離子自由基清除能力的測定

分別取0.8 mL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在試管中分別依次加入50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)4.5 mL和稀釋過的樣品液1 mL，然后加入3 mmol·L-1鄰苯三酚(用10 mmol·L-1HCl配制)0.5 mL，立刻放入比色皿中，于320 nm處每隔30 s測定一次吸光度值，計算5 min內(nèi)鄰苯三酚的自氧化速率為ΔA2/Δt，以蒸餾水代替樣品為空白組ΔA1/Δt，以10 mmol·L-1HCl代替鄰苯三酚作為參比溶液，超氧陰離子自由基清除率用X2表示，計算公式如下：

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

分別取50 μL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在每支試管中分別加入0.04 mg·mL-1DPPH-乙醇溶液4 mL，然后加入稀釋過的樣品液2 mL，搖勻后在室溫下避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光度為A2，以蒸餾水代替樣品為空白組A1，以不加DPPH-乙醇溶液的為參比溶液，DPPH自由基清除率用X3表示，計算公式如下：

1.3.7 ABTS自由基清除能力的測定

取7.4 mmol·L-1的ABTS儲備液和2.6 mmol·L-1的K2S2O8溶液等量混合，置于黑暗處反應(yīng)12～16 h，用蒸餾水稀釋45倍作為ABTS標(biāo)準(zhǔn)液，使其在734 nm處的吸光度值為0.7左右。分別取70 μL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在每支試管中分別加入ABTS標(biāo)準(zhǔn)液4 mL，然后加入稀釋過的樣品液1 mL，搖勻后在暗處靜置6 min，于734 nm處測定吸光度值為A2，以蒸餾水代替樣品為空白組A1，以不加ABTS標(biāo)準(zhǔn)液作為參比溶液，ABTS自由基清除率用X4表示，計算公式如下：

1.3.8 總還原力的測定

采用鐵氰化鉀法。分別取150 μL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在試管中分別依次加入稀釋過的樣品液1 mL、PBS(pH=6.6)2.5 mL，搖勻后在50 ℃水浴中靜置20 min，之后加入10 g·L-1的TCA 2.5 mL，靜置10 min后取上清液2.5 mL，加入0.1%氯化鐵0.5 mL和蒸餾水2.5 mL，搖勻后靜置10 min，于700 nm處測定吸光度值，以蒸餾水代替樣品參比溶液。以所測定的吸光度值的大小反映樣品還原能力的強(qiáng)弱，吸光度越大，還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.9 SOD酶活性的測定

根據(jù)1.3.5測得的超氧自由基清除率求得SOD酶活性，μmol·min-1·mL-1。

式中：X2為超氧陰離子自由基清除率，%；V總為反應(yīng)液的總體積，mL；V樣為加入樣品液的體積，mL；n為樣品稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮和總酚質(zhì)量濃度的變化

黃酮可以與自由基反應(yīng)鏈中的過氧自由基發(fā)生反應(yīng)，生成穩(wěn)定的半醌式自由基，從而達(dá)到清除自由基的目的，因此具有良好的抗氧化能力[8]。酚類物質(zhì)可以通過直接清除自由基、抑制氧化酶系、激活抗氧化酶系以及與過渡金屬螯合等方式而實現(xiàn)抗氧化作用，是極好的天然抗氧化劑[9]。發(fā)酵過程中總酚和黃酮質(zhì)量濃度的變化如圖3、圖4所示。

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可知，隨著發(fā)酵時間的延長，青梅中的黃酮被不斷浸出，在第72天達(dá)到最大值4.32 mg·mL-1，發(fā)酵后較發(fā)酵前增加了2.42 mg·mL-1。有研究表明[10]，發(fā)酵過程中黃酮質(zhì)量濃度與酒精體積分?jǐn)?shù)之間呈顯著的相關(guān)性，隨著微生物代謝產(chǎn)生的乙醇逐漸增多，青梅中的黃酮不斷被提取出來，酵素液中黃酮的質(zhì)量濃度隨之增加。總酚質(zhì)量濃度在發(fā)酵的前30 d快速增加，30 d以后質(zhì)量濃度增加趨緩，在第72天達(dá)到最大值3.33 mg·mL-1，整個發(fā)酵中總酚質(zhì)量濃度增加了1.85 mg·mL-1。這可能是因為在發(fā)酵前期，可溶性酚類物質(zhì)逐漸析出，同時微生物代謝產(chǎn)生的碳水化合物代謝酶將青梅中以共軛形式與糖、有機(jī)酸、胺和脂質(zhì)相連的酚類化合物進(jìn)行酶促水解，大分子酚類物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為小分子酚類物質(zhì)，從而增加了酵素中游離酚類物質(zhì)[11]的質(zhì)量濃度。Zhu等[12]通過實驗發(fā)現(xiàn)，楊梅果渣發(fā)酵過程中，類黃酮和總酚質(zhì)量濃度明顯增加，發(fā)酵后楊梅果渣液體比未發(fā)酵的楊梅果渣液體具有更高水平的抗氧化活性。Ding等[13]研究表明，發(fā)酵增加了黑大麥中類黃酮和總酚的質(zhì)量濃度并提高了其抗氧化能力。

2.2 羥基自由基清除能力的變化

在各種活性氧自由基中，羥基自由基的反應(yīng)活性和破壞作用最強(qiáng)。不同發(fā)酵時間的青梅酵素對羥基自由基的清除能力如圖5所示。

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可知，發(fā)酵的前30 d，青梅酵素對羥基自由基的清除能力迅速增大，在第30天達(dá)到最大清除率61.07%，之后清除能力趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束后羥基清除率達(dá)59.61%，較發(fā)酵前增加了31.28%。李飛等發(fā)酵的蘋果酵素對羥基自由基的清除能力最高達(dá)到了77%[14]。

2.3 超氧自由基清除能力的變化

超氧自由基在細(xì)胞氧化反應(yīng)中最先生成，它可以與羥基自由基共同引發(fā)脂質(zhì)過氧化，同時又可產(chǎn)生其他種類的有害自由基和氧化劑[15]。不同發(fā)酵時間的青梅酵素對超氧自由基的清除能力如圖6所示。

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可得，發(fā)酵前30 d超氧自由基清除能力增加了29.71%，第30天清除能力達(dá)到72.61%。30 d以后清除能力較之前有所浮動，但依然維持較高的清除率。可能是因為發(fā)酵過程中產(chǎn)生的SOD酶等抗氧化性酶的酶活力增大，有效地清除了氧自由基；同時，酚類化合物的游離羥基以及具有游離的3-羥基取代的類黃酮分子也具有良好的抗氧化能力[16]。

2.4 DPPH自由基清除能力的變化

DPPH作為一種穩(wěn)定的自由基，可以接受電子或氫自由基而成為穩(wěn)定的抗磁性分子，導(dǎo)致其顏色發(fā)生變化，因此被廣泛用于測量活性化合物的抗氧化能力[17]。不同發(fā)酵時間的青梅酵素對DPPH自由基的清除能力如圖7所示。

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可得，在發(fā)酵的前18 d，DPPH清除能力幾乎呈直線上升，18 d后清除能力基本保持穩(wěn)定，在發(fā)酵后期有小幅度增加，發(fā)酵78 d后，DPPH清除率達(dá)到68.62%，較發(fā)酵前增加了35%。據(jù)報道[18]，DPPH清除能力的變化主要與多酚質(zhì)量濃度的變化有關(guān)。

2.5 ABTS自由基清除能力的變化

相對DPPH自由基來說，ABTS自由基更易被清除且與抗氧化劑反應(yīng)時間更短，因此ABTS能更好地評價食品的抗氧化性能[19]。不同發(fā)酵時間的青梅酵素對ABTS自由基的清除能力如圖8所示。

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可得，在發(fā)酵的前30 d，ABTS自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，30 d之后清除率在70%上下波動，最高達(dá)到74.7%。發(fā)酵結(jié)束后，清除能力較發(fā)酵前增加了35.76%。蔣增良等[20]研究藍(lán)莓酵素的發(fā)酵過程中，ABTS清除能力與未發(fā)酵前相比僅增加了16.5%。

2.6 總還原力的變化

鐵氰化鉀還原法是一種廣泛用于測定抗氧化活性的方法，樣品的還原能力可以通過測量700 nm處的吸光度來表示，吸光度越大表明還原能力越強(qiáng)[21]。發(fā)酵過程中青梅酵素總還原力的變化如圖9所示。

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可得，發(fā)酵前42 d，還原力從0.19增加到0.45，42 d后還原力趨于穩(wěn)定，在第66天前后有小幅度增加。可能是因為發(fā)酵后期，溶解和轉(zhuǎn)化在酵素中的各種活性物質(zhì)達(dá)到飽和，質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。

2.7 SOD酶活力的變化

SOD酶是生物體內(nèi)抗氧化酶系的主要組成之一，它能快速清除體內(nèi)的氧自由基，保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷[22]。發(fā)酵過程中青梅酵素中SOD酶活性的變化如圖10所示。

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可得，發(fā)酵過程中SOD酶活力呈現(xiàn)先期快速增加、后期趨于穩(wěn)定的趨勢。在第30天達(dá)到最大活性108.92 μmol·min-1·mL-1，發(fā)酵結(jié)束后，SOD酶活力維持在108.45 μmol·min-1·mL-1。表明青梅酵素在發(fā)酵過程中具有良好的清除氧自由基的能力。

2.8 抗氧化性能與黃酮及總酚質(zhì)量濃度之間的相關(guān)性分析

通過SPSS軟件，研究ABTS清除能力、DPPH清除能力、超氧自由基清除能力、羥基清除能力以及還原力和黃酮及總酚質(zhì)量濃度之間的相關(guān)性。青梅酵素在自然發(fā)酵過程中抗氧化性能和黃酮及總酚質(zhì)量濃度之間的相關(guān)性分析如表1所示。

表1 抗氧化性能與總酚和黃酮之間的相關(guān)性

Wang等[23]通過研究表明，發(fā)酵后番石榴葉茶的可溶性酚提取物表現(xiàn)出更高的抗氧化活性，證實了可溶性酚是抗氧化活性和還原能力的主要貢獻(xiàn)者。蔣增良等[24]的實驗表明，葡萄酵素在自然發(fā)酵過程中具有良好的抗氧化性能，且與酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度呈顯著的正相關(guān)性。

表1結(jié)果顯示，青梅酵素在自然發(fā)酵的過程中，還原力、ABTS清除能力、DPPH清除能力、超氧自由基清除能力以及羥基自由基清除能力與黃酮和總酚質(zhì)量濃度之間均具有極顯著的正相關(guān)性(P<0.01)，且總酚質(zhì)量濃度與4種自由基的清除能力和還原力之間的相關(guān)性要大于黃酮。由此可知，青梅酵素在自然發(fā)酵過程中所表現(xiàn)出的良好的抗氧化能力主要和酚類物質(zhì)及黃酮有關(guān)。

3 結(jié)論

本文研究了78 d內(nèi)青梅經(jīng)自然發(fā)酵制備青梅酵素過程中活性成分的變化規(guī)律，并測定了它們的抗氧化性能。結(jié)果顯示，羥基自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力在發(fā)酵前期均呈現(xiàn)出快速增加的趨勢，中后期略有波動或小幅度增加，還原力也呈現(xiàn)出先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，這和總酚質(zhì)量濃度變化趨勢相似。黃酮質(zhì)量濃度在整個發(fā)酵過程中逐步增加，SOD酶活力亦是先期快速增加后趨于穩(wěn)定。還原力以及4種自由基的清除能力和黃酮及總酚質(zhì)量濃度變化之間均呈現(xiàn)極顯著的相關(guān)性(P<0.01)，并且和總酚質(zhì)量濃度的相關(guān)性要高于黃酮。青梅酵素在自然發(fā)酵的過程中表現(xiàn)出良好的抗氧化能力，這主要與酚類物質(zhì)和黃酮質(zhì)量濃度的變化有關(guān)。